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銀杏(Ginkgo biloba Linn)為銀杏科銀杏屬 落葉高大喬木，系侏羅紀的孑遺植物，是植物界 的“活化石”，我國已將其列為二級重點(diǎn)保護植物。 銀杏中含有多種化學(xué)成分，其中具有藥用價(jià)值的成分主要為黃酮類(lèi)化合物，萜內酯類(lèi)化合物和酚 酸類(lèi)化合物nj。目前對黃酮類(lèi)化合物的研究較廣 泛深入，但隨著(zhù)近年銀杏內酯的藥理作用及臨床效果的廣泛報道，關(guān)于銀杏內酯類(lèi)化合物的研究 呈迅猛增長(cháng)的趨勢。銀杏內酯的藥理作用主要是 抑制血小板凝集、降低血液粘度、減少血栓形成、改善缺血病人微循環(huán)_2 ]，在各種銀杏內酯單體中 銀杏內酯B的抗PAF(血小板活化因子)活性最 強。目前得到銀杏內酯B的主要途徑是從銀杏 葉中直接提取，這難免會(huì )導致資源的枯竭，而且生 產(chǎn)也受到很大的限制。植物內生真菌幾乎存在于 所有目前已研究過(guò)的植物中，并且一些內生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分。已 經(jīng)先后從紅豆杉、長(cháng)春花、桃兒七、杜仲等植物中 分離出能夠產(chǎn)生活性成分的內生真菌_6。，近幾 年也有報道從銀杏中分離出產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物的內生真菌⋯]，但從銀杏中分離的內生真菌中產(chǎn)銀杏 內酯的研究報道較少，本文試圖從銀杏中分離產(chǎn) 銀杏內酯的內生真菌，并對菌類(lèi)進(jìn)行初步鑒定，探討發(fā)酵法生產(chǎn)銀杏內酯的可能性，為今后的工 業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 菌種分離源 分離所用材料為銀杏的根、 莖、葉和果，于2006年10月采自西北農林科技大 學(xué)林學(xué)院校園內，樹(shù)齡從
1．1．2 培養基 菌種分離用培養基：馬鈴薯葡萄 糖瓊脂培養基(PDA)、察氏培養基。液體培養基：馬鈴薯葡萄糖培養基。
1．1．3 主要儀器 SW2CJ2FD超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、ES2315高壓滅菌鍋(TO— MY)、SPX2300B2 1I生化培養箱(上海躍進(jìn)醫療 器械廠(chǎng))、HWY211大容量恒溫振蕩器、V 8三用 紫外分析儀(無(wú)錫科達儀器廠(chǎng))、LC
1．1．4 標準標品和試劑 銀杏內酯B標品純度大于99 硅膠H(青島 海洋化工廠(chǎng))；醋酸鈉(分析純)；羧甲基纖維素 鈉(上海試劑廠(chǎng))；乙酸酐(廣州試劑廠(chǎng))；甲苯 (分析純)，乙酸乙酯(分析純)，丙酮(分析純)，甲 醇(分析純)，甲醇(色譜純)，重蒸水，四氫呋喃 (色譜純)。
1．2 方法
1．2．1 內生真菌的分離、純化和保藏
采用 常規組織分離法，分別取銀杏的根、莖、葉、樹(shù)皮和果實(shí)，用75 乙醇浸泡1 min，然后用無(wú)菌水沖洗 3～4次，再用2．5 次氯酸鈉浸泡3 min，將組織 切割成0．
1．2．2 內生真菌的液體培養 液體培養基為馬 鈴薯葡萄糖培養基，
1．2．3 薄層層析法(TLC)檢測Ⅲ1。薄層板：4 乙酸鈉的0．5 羧甲基纖維素鈉溶液作粘合劑的硅膠H板；展開(kāi)劑：甲苯：乙酸乙酯：丙酮：甲 醇一5：2．5 ：2．5 ：0．3，將制好晾干的薄層板置于
1．2．4 高效液相色譜法(HPLC)檢測 采用單 點(diǎn)校正的辦法來(lái)定量銀杏內酯B的含量。精密 稱(chēng)取銀杏內酯B標品5 mg溶解于
1．2．5 菌種鑒定 真菌鑒定按常規方法進(jìn) 行。挑取純化的菌株尖端菌絲接種于察氏培養基 上。按如下各種方法培養一段時(shí)間后觀(guān)察菌落、 菌絲體和孢子的形態(tài)特征并進(jìn)行鑒定。
載片培養觀(guān)察法(觀(guān)察孢子及菌絲體形態(tài))： 將培養基瓊脂薄置載玻片上，接種后蓋上蓋玻片 培養，真菌即在載玻片與蓋玻片之間有限的空間內沿蓋玻片橫向生長(cháng)。培養一段時(shí)間后，將載玻 片置顯微鏡下觀(guān)察。插片法(觀(guān)察基內、氣生菌絲)：將真菌接種到平板上，插上滅菌蓋玻片后培 養，使菌絲沿著(zhù)培養基表面與蓋玻片的交接處生 長(cháng)而附著(zhù)在蓋玻片上。觀(guān)察時(shí)輕輕取出蓋玻片，置載玻片上直接觀(guān)察。
2 結果與分析
2．1 銀杏內生真菌分離
從銀杏的不同部位共分離到109株內生真 菌，其中從樹(shù)根、皮、葉子和果實(shí)中分離到的菌株 數分別為33、15、57和4株。從分離純化的結果來(lái)看從樹(shù)根和樹(shù)葉中所分離到的內生真菌較樹(shù)皮 和果實(shí)中的數量多。
2．2 薄層層析(TLC)法分析結果
用展開(kāi)體系對分離到的109株內生真菌發(fā)酵 濃縮液進(jìn)行層析，初步篩選能夠產(chǎn)生銀杏內酯B或其類(lèi)似物的菌株，結果發(fā)現有16株菌和標品有 相同的遷移位點(diǎn)和相似的斑點(diǎn)顏色，圖1為G10 菌株樣品的薄層色譜分析圖譜，在加入改良劑醋 酸鈉的情況下可使得薄層分析的精度得到很大的 提高，可以去除銀杏內酯其他單體的干擾作用，但是因為發(fā)酵液樣品中可能存在其他雜質(zhì)，致使薄 層分析結果容易出現假陽(yáng)性，故對初步篩選出來(lái) 的16株菌進(jìn)行了液相色譜分析。
2．3 高效液相色譜(HPLC)法分析結果
對TLC方法初步篩選出來(lái)的16株菌的發(fā)酵 濃縮液進(jìn)行HPLC分析，在1．2．4中的條件下， 標樣的保留時(shí)間為29．361min，16個(gè)樣品中編號為G10、Y3o和Y4o的3個(gè)樣品和標樣有相近的 保留時(shí)間，分別為29．531、29．460和29．949 min。根據出峰面積采用單點(diǎn)校正自龜方法計算出 發(fā)酵產(chǎn)量分別為9．3 mg／I 24．3 mg／L和64．3 mg／L，但TLC分析中樣品Y30和Y40的斑點(diǎn)顏 色和標品銀杏內酯B斑點(diǎn)顏色不相符合，它們產(chǎn)生的是否為銀杏內酯B，還有待于進(jìn)一步試驗。 故只確認菌株GlO產(chǎn)生銀杏內酯B。試驗中發(fā)現 在薄層板上樣品G1和G8與標品不但有相同的遷移率而且有相同的斑點(diǎn)顏色，但在液相色譜的 色譜圖上沒(méi)有發(fā)現和標品有相同保留時(shí)間的出 峰。推測原因可能是發(fā)酵液中目標產(chǎn)物濃度低，加上銀杏內酯類(lèi)物質(zhì)紫外吸收很弱，因此在色譜圖上沒(méi)有檢測到該樣品中含有該物質(zhì)。圖2和圖 3為標品和樣品Glo的HPLC圖譜。
2．4 內生真菌鑒定
從銀杏中共分離出109株內生真菌，對在TLC 分析和HPLC中與標品有相同遷移率和相同保留時(shí)間的3株內生真菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)顯微形態(tài)觀(guān)察， 初步判定GlO為卵形孢霉屬(Oospora Wallr．)、 Y30為枝鏈孢霉屬(Sirodesmium de Not)、Y40為青霉屬(Penicillium LK．ex Fries)，其生長(cháng)特性和顯微形態(tài)及鑒定結果見(jiàn)表1
3 結論
3．1 采用常規的組織分離方法從銀杏植物不同組 織部位共分離出內生真菌109株，其中從樹(shù)根中分 離到的有33株、樹(shù)皮中15株、葉中57株、果實(shí)中4 株，這表明在健康的銀杏組織內部確實(shí)存在大量的 不使宿主植物表現出明顯感染癥狀的內生真菌，而 且其數量分布跟宿主植物的組織部位有關(guān)。
3．2 TI C分析結果發(fā)現有16株菌與標品有相 同的遷移位點(diǎn)和相似的斑點(diǎn)顏色，HPI C進(jìn)一步 分析后觀(guān)察到有3株菌的發(fā)酵濃縮液與標品有相同的保留時(shí)間，綜合在薄層板上的熒光顯色和在液相色譜上的保留行為確定菌株G10為可以產(chǎn) 生銀杏內酯B的內生真菌，表明從宿主植物中分離到的部分內生真菌確實(shí)可以產(chǎn)生和宿主植物內部 含有的相同的生物活性物質(zhì)。試驗中發(fā)現菌株G1 和G8在薄層板上和標品有相同的遷移率和相同 顏色的斑點(diǎn)，但在液相色譜上卻沒(méi)有顯示出來(lái)有相 同保留時(shí)間的出峰，推測菌株G1和G8也可能產(chǎn) 生銀杏內酯B，但含量很少，用HPLC-UV檢測不 出來(lái)。因此選擇G10為后續試驗的出發(fā)菌株。
3．3 對液相色譜分析中有相同保留時(shí)間的3株 菌G10、Y30和Y40進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察，包括菌落 形態(tài)、菌絲體生長(cháng)狀態(tài)和分生孢子的著(zhù)生情況，初步鑒定分別為卵形孢霉屬(Oospora wallr．)、枝鏈 孢霉屬(Sirodesrniurn de Not)和青霉屬(Penicil— Zium LK．ex Fries)
作者：包飛、樊明濤、賀江
作者單位：西北農林科技大學(xué)食品科技與工程學(xué)院
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