短小芽孢桿菌作試驗菌測定四環(huán)素類(lèi)抗生素效價(jià)

摘要　采用管碟法，測定短小芽孢桿菌對四環(huán)素類(lèi)抗生素的敏感度，并與藤黃微球菌進(jìn)行比較。結果概率分析表明，兩種試驗菌測定的效價(jià)無(wú)顯著(zhù)差異，表明短小芽孢桿菌法優(yōu)于中國藥典1995年版方法。
　　四環(huán)素類(lèi)抗生素(土霉素、金霉素、四環(huán)素等)微生物檢定法采用的試驗菌種，各國藥典規定不一。英國藥典^〔1〕采用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，美國藥典^〔2〕采用金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，日本標準^〔3〕與中國藥典^〔4〕均采用藤黃微球菌(Micrococcus lutea)。鑒于以藤黃微球菌作試驗菌存在諸多缺點(diǎn)(菌種容易變異、培養時(shí)間長(cháng)、抑菌圈邊緣欠清晰、測定結果誤差大)，而英美兩國藥典所收載的色譜法^〔1，2〕在我國目前又難于普及，本文試用短小芽孢桿菌作為四環(huán)素類(lèi)抗生素效價(jià)測定的試驗菌種，并獲較滿(mǎn)意結果。
　　1　材料
　　1.1　藥品　四環(huán)素類(lèi)抗生素(西安藥廠(chǎng)、光華藥廠(chǎng)及福州抗生素廠(chǎng)等，包括原料藥、片劑、軟膏)；四環(huán)素類(lèi)抗生素標準品(中國藥品生物制品檢定所)。
　　1.2　實(shí)驗菌株　短小芽孢桿菌〔CMCC(B)63202〕(按中國藥典1995版二部附錄72頁(yè)方法制成透光率為25%的菌液)；藤黃微球菌〔CMCC(B)28001〕(制成透光率為20%的菌液)。
　　1.3　培養基　Ⅰ號培養基pH 7.8～8.0，Ⅱ號培養基pH 6.6(中國藥品生物制品檢定所)。
　　1.4　磷酸鹽緩沖液　pH6.0緩沖液(KH₂PO₄ 8 g，K₂HPO₄ 2 g，加水至1L；pH8.0緩沖液(KH₂PO₄ 0.523 g，K₂HPO₄ 16.73 g，加水至1L)；pH 4.5緩沖液(KH₂PO₄ 13.6 g，加水至1L)。
　　2　方法
　　采用短小芽孢桿菌：一劑量法^〔5〕測定四環(huán)素與土霉素效價(jià)的標準曲線(xiàn)劑間比例為1∶0.8，中心濃度為8 u/ml，濃度范圍為4～20 u/ml。二劑量法^〔4〕高低劑量分別為8，4 u/ml。一劑量法測定金霉素效價(jià)的標準曲線(xiàn)劑間比例為1∶0.8，中心濃度為1 u/ml，濃度范圍為0.25～10 u/ml。二劑量法高低劑量分別為1，0.5 u/ml。
　　采用藤黃微球菌：標準曲線(xiàn)制備同中國藥典1977年版，二劑量法按中國藥典1995年版操作。
　　2　結果
　　2.1　抑菌圈　采用pH6.0磷酸鹽緩沖液及Ⅱ號培養基，短小芽孢桿菌的抑菌圈清晰度較好。按2%～3%比例將短小芽孢桿菌液加入培養基作為菌層，35℃～37℃的條件下培養14～16 h，所得到的抑菌圈大小較為合適(表1)。
表1　短小芽孢桿菌測定抑菌圈直徑(mm)

樣品	菌液加入量(%)	高劑量	低劑量
四環(huán)素	2	22	19
土霉素	2	21	18
金霉素	3	20	17

2.2      試驗菌測定的標準曲線(xiàn)　見(jiàn)表2。

 表2　兩種試驗菌標準曲線(xiàn)斜率

樣品	短小芽孢桿菌	藤黃微球菌
四環(huán)素	1.67	1.41
土霉素	1.13	1.18
金霉素	1.36	1.49

2.3      兩種試驗菌測定的效價(jià)　表3～5�！�

表3　兩種試驗菌測定土霉素效價(jià)對比

樣品*	序號	短小芽孢菌	藤黃微球菌	差值
片劑(%)	1	72.3	73.9	－1.6
	2	93.6	93.1	0.5
	3	69.2	69.5	－0.3
	4	98.3	100.1	－1.8
	5	82.2	79.7	2.5
	6	95.4	93.1	2.3
	7	81.3	82.6	－1.3
	8	81.9	81.5	0.4
	9	92.0	91.0	1.0
	10	101.9	102.8	－0.9
原料(u/mg)	11	93.8	92.4	1.4
	12	878	878	0
	13	876	874	4
	14	876	875	1
	15	874	873	1
	16	865	875	－10
	17	859	875	－10

　　注：^*序號12～17樣品數據由西安光華制藥廠(chǎng)提供

表4　兩種試驗菌測定四環(huán)素效價(jià)對比

樣品*	序號	短小芽孢桿菌	藤黃微球菌	差值
片劑(%)	1	78.5	76.4	2.1
	2	97.1	91.7	5.4
	3	86.2	89.1	－2.9
	4	94.2	95.8	－1.6
	5	81.3	82.6	－1.3
	6	85.2	86.1	0.9
原料(u/mg)	7	999	978	21
	8	986	978	8
	9	986	976	10
	10	976	979	－3
	11	994	989	5
	12	988	979	9
	13	991	988	3
	14	983	979	4
	15	985	979	6
	16	986	980	6
	17	987	981	6
	18	976	970	6
粗制品(u/mg)	19	716	704	－12
	20	682	681	1

　　注：^*序號8～19樣品數據由西安制藥廠(chǎng)提供

表5　兩種試驗菌測定金霉素效價(jià)對比

樣品	序號	短小芽孢桿菌	藤黃微球菌	差值
原料(u/mg)	1	890.0	896.8	－6.0
	2	877.1	893.6	－16.5
	3	881.0	884.0	－3
	4	871.0	868.2	2.8
	5	888.6	873.4	15.2
	6	906.7	916.9	－10.2
軟膏(%)	7	103.8	103.8	0

2.4      雜質(zhì)含量測定　結果見(jiàn)表6。

表6　兩種試驗菌測定四環(huán)素產(chǎn)品雜質(zhì)含量結果(u/mg)

雜質(zhì)名稱(chēng)	短小芽孢桿菌	藤黃微球菌	差值
4-差向四環(huán)素	394.8	372.0	22.8
脫水差向四環(huán)素	5.9	6.0	－0.1
脫水四環(huán)素	17.6	7.6	10.0

　　 4　討論與小結　　①表2顯示，兩種試驗菌測定結果無(wú)顯著(zhù)差異，曲線(xiàn)斜率均較穩定，兩條直線(xiàn)互相平行。②表3～表5列出四環(huán)素(20批)、土霉素(17批)及金霉素(7批)的考核數據。概率分析表明，兩種試驗菌測定的效價(jià)無(wú)顯著(zhù)差異(P＞0.05)。③四環(huán)素類(lèi)抗生素不夠穩定，尤其是四環(huán)素與金霉素的差向化均較快，產(chǎn)品中差向金霉素含量可高達16%～17%。表6顯示，兩種試驗菌對各種雜質(zhì)的敏感度無(wú)明顯差異(表中脫水四環(huán)素之測定含量?jì)身棓祿�，有待進(jìn)一步予以驗證)。④四環(huán)類(lèi)抗生素微生物檢定法改用短小芽孢桿菌測定的優(yōu)點(diǎn)在于：菌液穩定，可保存較長(cháng)時(shí)間，供隨時(shí)取用，無(wú)需臨時(shí)制備；菌種靈敏；抑菌圈成形快(培養時(shí)間短于15 h)；抑菌圈清晰，邊緣整齊，便于準確測量，故而誤差小，復試率低；菌液耐溫，可在70℃左右的培養基上攤布菌層。

作者：傅燕芳  張正潔  張玉良  李曉珍

作者單位：西安市藥品檢驗所!西安710054 西安制藥廠(chǎng) 西安制藥廠(chǎng) 西安市藥品檢驗所!西安710054
　　參考文獻
　　1　BP 1993：150，472，661；A166
　　2　USP ⅩⅩⅢ,1995:1510,621(1221)
　　3　日本抗生物質(zhì)醫藥品基準解說(shuō)1990：333
　　4　中國藥典1995年版二部.1995：附錄70～74
　　5　中國藥典1977年版二部.1997：附錄

 

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