檸檬醛抗真菌及抑制黃曲霉產(chǎn)毒的試驗報告

摘要：采用平板法比較了檸檬醛與合成食用防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀對5種霉菌和5種酵母菌的抗菌效力。結果表明，在培養基pH4.5時(shí)，檸檬醛對多數試驗真菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.10％～0.15％，與山梨酸鉀的抗菌效力相近，優(yōu)于苯甲酸鈉。在添加0.15％檸檬醛的麥芽汁搖床試驗中發(fā)現，魯氏酵母生長(cháng)曲線(xiàn)的調整期比對照組延長(cháng)，對數生長(cháng)期和穩定期縮短，細胞總數減少了55％。同時(shí)，檸檬醛與黃曲霉產(chǎn)毒關(guān)系的試驗顯示，檸檬醛對黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素具有較強的抑制作用，可以減少81％以上的毒素產(chǎn)生。
關(guān)鍵詞：檸檬醛；真菌；抗菌效力；黃曲霉毒素
前言
　檸檬醛系香葉醛(反式甲位檸檬醛，geranial)和橙花醛(順式乙位檸檬醛，neral)的混合物，無(wú)色或微黃色液體，呈濃郁檸檬果香味，是我國允許使用的食品增香劑[1]，而且它還是合成紫羅蘭酮系列高級香料的重要原料。檸檬醛有天然品及人工合成兩種。天然檸檬醛存在于山蒼子油、檸檬草油、檸檬油、白檸檬油、柑桔類(lèi)葉油等許多種芳香植物的精油中，其中山蒼子精油是檸檬醛的最主要來(lái)源。山蒼子主產(chǎn)于我國長(cháng)江流域以南及東南亞地區，我國是山蒼子精油的最大生產(chǎn)國。
　余伯良(1998)報道，山蒼子精油對多種霉菌具有抗菌性，而且對黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素有較強的抑制作用。檸檬醛是山蒼子精油的最大組分，含量為66％～80％。因此，有必要研究檸檬醛是否抗真菌及其與黃曲霉產(chǎn)毒的關(guān)系。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種黃曲霉(Aspergillusflavus)，桔青霉(Penicilliumcitrimum)，總狀毛霉(Mucorracemosus)，禾谷鐮刀霉(Fusariumgraminearum)，黑根霉(Rhizopusnigricans)，魯氏酵母(Saccharomycesrouxii)，啤酒酵母(Sacch.ceravisiae)，粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)，浮膜假絲酵母(Candidamycoderma)，異常漢遜氏酵母(Hansenulaanomala)。
　菌種中的黃曲霉、總狀毛霉系自制花生醬在28～32℃下敞開(kāi)放置7d，從表層霉菌中分離、鑒定的主要兩株霉菌。其中黃曲霉為產(chǎn)毒菌株，該試樣用層析法[3]檢測，其黃曲霉毒素B1(AFTB1)含量為5.87mg/kg。其他菌種來(lái)源于中科院微生物所和成都生物所，由本院菌種室提供。
1.1.2試劑檸檬醛：采用真空分餾的單離方法從山蒼子油中提取，質(zhì)量符合FAO/WHO(1981)標準(山蒼子油購自成都香料總廠(chǎng)，質(zhì)量符合ISO3214－1974(E)標準；
　1，2—丙二醇、苯甲酸鈉及山梨酸鉀均為AR級，硅藻土cp級；
　AFTB1標準溶液：購自國內貿易部谷物油脂化學(xué)研究所標準室，濃度為1.00ug/mL；
　檢測AFTB1的硅膠薄層層析法所使用的儀器和試劑符合GB8381－87標準要求。
1.1.3培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA瓊脂)培養基和麥芽汁培養基。
　花生察氏培養基，配方如下：蔗糖30.0g、K₂HPO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaNO₃3.0g、KCl0.5g、FeSO₄0.01g、ZnSO₄0.4mg、花生水抽提液1000mL及瓊脂15.0g，調節pH至5.5(添加ZnSO40.4mg/L對產(chǎn)黃曲霉毒素有促進(jìn)作用)。
　花生水抽提液制法：挑選新鮮、無(wú)霉花生仁200g，浸泡6h，加蒸餾水1200mL，先后用磨漿機、膠體磨研磨成乳漿狀，然后用多層紗布過(guò)濾，濾紙抽濾，取其濾液1000mL備用(若不足1000mL，須補充蒸餾水至足量)。
1.2方法
1.2.1平板法測檸檬醛的最低抑菌濃度(MIC)　將檸檬醛和苯甲酸鈉、山梨酸鉀分別用無(wú)菌丙二醇和無(wú)菌蒸餾水稀釋成9.0％、8.0％、7.0％至1.0％共9個(gè)重量百分比濃度梯度備用。
　分別挑取經(jīng)PDA和麥芽汁瓊脂活化培養的上述5種霉菌孢子和酵母菌，用無(wú)菌生理鹽水制成混懸液(霉菌孢子濃度約為1×10⁶個(gè)孢子/mL，酵母菌液濃度約為3×10⁵個(gè)/mL)。作涂菌用，須在24h內使用。
　分別調節PDA瓊脂和麥芽汁瓊脂培養基，分裝于若干支試管中(每支19mL)。滅菌后待降溫至60℃左右，分別吸取檸檬醛、苯甲酸鈉、山梨酸鉀三種試劑的稀釋液1mL加入各自試管中，充分搖勻，于50℃左右倒置平皿，含每種試劑的兩種培養基各倒27付(摻入相同濃度同一試劑的同種培養基倒置3付平皿，9個(gè)濃度梯度則為27付)。另外3支PDA瓊脂和3支麥芽汁瓊脂試管各裝培養基19mL，不摻入試劑，分別加入1mL丙二醇溶劑，搖勻后倒置平皿作對照(每次試驗用對照皿2個(gè)，PDA和麥芽汁瓊脂各一皿)。
　在每個(gè)平皿底部外面用記號筆畫(huà)“大”字，并作標記。同種試劑相同濃度的兩個(gè)培養基平皿共接5種霉菌和5種酵母菌(每種菌分別涂在“大”字的5個(gè)空隙位置上，切忌混菌污染)。對照組也涂菌，也是兩皿涂10種菌。28℃培養48h，觀(guān)察結果，以肉眼看不到酵母菌菌落、霉菌菌絲生長(cháng)的最低試劑濃度為該試劑的MIC(做3次平行試驗，以2次或3次相同結果的為準)。
1.2.2檸檬醛對酵母細胞生長(cháng)繁殖影響試驗酵母菌是單細胞，可以通過(guò)生長(cháng)曲線(xiàn)的變化來(lái)考察檸檬醛對其生長(cháng)繁殖的影響。我們以魯氏酵母為例，采用恒溫搖床培養，光電比濁法測定OD值(代表增殖細胞總數)，以及美蘭染色血球計數板法(測定活細胞)相結合，繪制魯氏酵母在添加了0.15％檸檬醛的培養基和空白條件下各自的生長(cháng)曲線(xiàn)。主要步驟如下：
　①將澄清的麥芽汁加水稀釋成10°Bx′麥芽汁培養基，自然pH，分裝于9個(gè)300mL的具有側臂試管的三角燒瓶中，每瓶裝38mL，常規滅菌。其中3瓶為試驗組，添加0.15％檸檬醛(即魯氏酵母MIC低一個(gè)濃度梯度)試劑2mL；另外3瓶為不添加任何試劑的試驗對照組(在培養基中加入2mL無(wú)菌丙二醇)；剩下的3瓶作為測定光密度(OD值)的空白對照。
　②試驗組和試驗對照組每瓶均接種搖勻的酵母菌液4mL，置于臺式萬(wàn)能搖床中，28℃恒溫振蕩培養。開(kāi)始時(shí)將剛剛接種的培養液搖勻后傾入側臂試管中，置于自制的“721”分光光度計比色管架上，用721型分光光度計測定菌液(細胞總數)濃度(光密度值)，此時(shí)所測讀數為“0”時(shí)讀數值(即接種量)。之后，在恒溫振蕩培養過(guò)程中每隔5h用相同方法測OD值，共測14次，至培養70h為止。比色時(shí)，均用無(wú)菌的相同培養液作空白對照，予以校正。用560nm波長(cháng)測定。三次平行實(shí)驗，求其平均值。
　另外，用顯微鏡測微尺測定試驗組和對照組對數生長(cháng)期酵母細胞大小，隨機各測5個(gè)細胞，取其平均值。
1.2.3檸檬醛與黃曲霉產(chǎn)毒關(guān)系試驗參考“培養皿中熒光反應法”，首先做檸檬醛是否抑制黃曲霉產(chǎn)毒的定性試驗。具體做法是：將花生察氏培養基溶化，分別放入若干支試管中(每支19mL)，待降溫至60℃左右，各自加入1mL用丙二醇稀釋的不同濃度的檸檬醛(體積百分比濃度分別為5.0％、4.0％、3.0％、2.0％、1.0％)，每種濃度加3管。作對照的3支試管僅加入19ml花生察氏培養基和1mL丙二醇。各試管搖勻，緩緩傾入硅藻土薄層平皿中。接種黃曲霉，28℃培養6d后于125W紫外燈下觀(guān)察(濾光片波長(cháng)365nm)，如果菌絲體上顯現亮藍紫色熒光則表示有黃曲霉毒素產(chǎn)生(作3次平行試驗，以2次或3次相同結果的為準)。選取各試劑陽(yáng)性平皿中最具代表性的一個(gè)平皿(即菌絲生長(cháng)與對照皿相近，而熒光反應卻比對照皿弱的)及丙二醇對照樣本，用硅膠薄層層析法分別測定各陽(yáng)性皿及對照皿中培養基的AFTB1含量。各測2次，取其平均值。
2結果與討論2.1檸檬醛與合成食用防腐劑的MIC值比較　MIC值越低，表明相應試劑的抗菌效力越強。從表1可知，檸檬醛對10種試驗菌(5種霉菌和5種酵母菌)中的7種其MIC值為0.10％～0.15％，其抗菌效力與公認較好的合成食用防腐劑山梨酸鉀相近，而優(yōu)于苯甲酸鈉。從檸檬醛對霉菌、酵母菌抗菌效能總體看，檸檬醛對霉菌的抗菌效力比對酵母菌強，此點(diǎn)也與山梨酸鉀相似。但是，苯甲酸鈉和山梨酸鉀都是酸性防腐劑，在基質(zhì)pH4.5以下時(shí)抗菌效力較強，隨著(zhù)pH上升其抗菌效力減弱，當基質(zhì)pH5.5以上時(shí)，苯甲酸鈉幾乎無(wú)抗菌作用，山梨酸鉀在基質(zhì)pH6.0以上時(shí)，抗菌效力也相當弱。而檸檬醛對霉菌的抗菌效力受基質(zhì)pH影響較小，其抗菌活性pH范圍較廣，在3.5～7.5之間。表1檸檬醛等三種試劑的MIC值（單位：％）

注：培養基pH4.5。

2.2檸檬醛對酵母細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的影響
 　從圖1可以看出，空白對照魯氏酵母的調整期是9h，而含有檸檬醛的培養基酵母菌的調整期是22h，明顯延長(cháng)，超過(guò)空白樣的1倍以上；空白對照樣的對數生長(cháng)期是21h，而試驗樣的對數生長(cháng)期是8h，縮短了1.6倍；空白對照樣的穩定期大約是30h，而試驗樣的穩定期只有17h，縮短了43％。再從對數生長(cháng)期末細胞總數測定點(diǎn)看，空白對照樣的C點(diǎn)OD值是0.49，而對照樣的C’點(diǎn)OD值僅0.24，其細胞總數僅相當于空白對照樣的49％�！×硗�，從對數生長(cháng)期細胞大小測定看，試驗樣平均細胞大小比空白對照樣小18％左右，試驗樣的細胞發(fā)育受到影響�！∮纱丝梢�(jiàn)，檸檬醛對易引起多種食品腐敗變質(zhì)的魯氏酵母生長(cháng)繁殖的影響是顯著(zhù)的：生長(cháng)適應的調整期延長(cháng)，對數生長(cháng)期和穩定期縮短，細胞總數減少了55％，細胞個(gè)體平均較對照組為小。酵母菌與霉菌同屬于真菌，有一些共同之處，可以推測，檸檬醛對霉菌生長(cháng)繁殖的抑制也可能有類(lèi)似情況。2.3檸檬醛對黃曲霉產(chǎn)毒的影響表2檸檬醛對黃曲霉產(chǎn)毒的影響

注：菌絲生長(cháng)情況：“—”表示肉眼看不到菌絲，無(wú)霉斑；“＋”表示能看到稀少的菌絲或發(fā)芽孢子，無(wú)霉斑；“＋＋”表示能看到較多的菌絲或出現霉斑；“＋＋＋”則指試樣表面幾乎全部被菌絲及孢子覆蓋或出現霉斑�！�熒光強弱：“○”為無(wú)熒光；“＋，＋＋，＋＋＋”為強度依次遞增。黃曲霉毒素B1值為2次平行試驗平均值�！�從表2可見(jiàn)，添加0.10％、0.05％檸檬醛的花生察氏培養基接種產(chǎn)毒黃曲霉培養6d，其菌絲生長(cháng)情況與對照組相近，而熒光反應卻較對照組為弱，說(shuō)明檸檬醛有抑制黃曲霉產(chǎn)毒的作用,其中添加了0.10％檸檬醛的試驗皿具有代表性(菌絲生長(cháng)與對照組相近，而熒光反應卻較添加0.05％檸檬醛的更弱，說(shuō)明產(chǎn)毒受到的抑制更強)�！∵x取添加0.10％檸檬醛的花生察氏培養基的樣本及對照組樣本，分別用硅膠薄層層析法測定AFTB1。重復一次，取平均值。添加0.10％檸檬醛的花生察氏培養基其AFTB1為1.14mg/kg(檢測兩次數據分別為1.20mg/kg、1.08mg/kg)，對照組樣品AFTB1為6.08mg/kg(5.98mg/kg、6.18mg/kg)。在有利于黃曲霉生長(cháng)的花生察氏培養基中添加了促進(jìn)黃曲霉毒素產(chǎn)生的微量元素Zn，在這樣的培養基中，由于添加了0.10％檸檬醛使AFTB1的產(chǎn)生減少了81％，可見(jiàn)檸檬醛抑制黃曲霉產(chǎn)毒的效果是顯著(zhù)的。

3結語(yǔ)　天然檸檬醛是山蒼子油的最大組分，對多種真菌的抗菌效力與公認較好的合成食用防腐劑山梨酸鉀相近，明顯優(yōu)于苯甲酸鈉，而且檸檬醛的抗菌活性pH范圍較寬廣，不僅對酸性食品有效，對中性食品也有效。而且檸檬醛能顯著(zhù)抑制魯氏酵母的生長(cháng)繁殖，對多種酵母也有抗菌效力。同時(shí)，檸檬醛對黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素有較強的抑制作用，可以使毒素的產(chǎn)生減少81％。檸檬醛具有濃郁的檸檬果香味，不僅是很好的食品增香劑，而且還可以作為食品特別是易污染霉菌及黃曲霉毒素的花生、玉米類(lèi)食品如花生蛋白飲料、花生糖果、花生醬以及玉米快餐食品等的良好防腐保鮮劑。

作者：余伯良  羅惠波  周健  張佳寧  

作者單位：四川輕化工學(xué)院 四川輕化工學(xué)院 四川輕化工學(xué)院 四川輕化工學(xué)院

上一篇：白色念珠菌誘導小鼠胸腺細胞凋亡的基因調控

下一篇：產(chǎn)銀杏內酯B內生真菌的分離與篩選