福氏志賀菌對諾氟沙星耐藥性及耐藥機制的研究

摘要　目的:研究福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥性及耐藥機制。方法:收集福氏志賀菌30株，進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗，4株耐藥菌，1株敏感菌和福氏志賀菌標準菌51573的gyrA基因的N末端編碼區進(jìn)行PCR擴增并克隆和測序。結果:福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥率高達53.3%，gyrA基因的序列分析結果揭示存在3個(gè)導致氨基酸改變的基因點(diǎn)突變：絲氨酸-83→亮氨酸，天冬氨酸-87→天冬酰氨，天冬氨酸-87→甘氨酸。結論:福氏志賀菌對諾氟沙星已有較高的耐藥性，gyrA基因點(diǎn)突變與福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥性有關(guān)。

　　　關(guān)鍵詞:志賀菌屬　諾氟沙星　gyr A基因

　　80年代開(kāi)始諾氟沙星作為新一代的氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，對氨芐西林等耐藥的多重耐藥志賀菌表現出強大的殺菌活力，志賀菌的藥物敏感率在95%以上^{［1，2］}。為了解福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥性和耐藥機制，我們收集了30株福氏志賀菌進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗，對其中4株耐藥菌、1株敏感菌和福氏志賀菌標準菌51573的gyr A基因的N末端編碼區進(jìn)行了聚合酶鏈反應(PCR)擴增并克隆和序列分析以檢測gyr A基因突變。

　　材料和方法

　　一、菌株的收集

　　30株福氏志賀菌于1996年8月在浙江省余杭市第一醫院從臨床糞便培養標本中分離所得，均經(jīng)過(guò)常規生化和血清學(xué)鑒定。隨機對其中4株耐藥菌、1株敏感菌和福氏志賀菌標準菌51573進(jìn)行分子生物學(xué)研究，志賀菌屬診斷血清購自衛生部蘭州生物制品研究所。福氏志賀菌標準菌51573購自中國藥品生物制品檢定所。

　　二、抗菌藥物敏感試驗

　　紙片法采用Kirby-Bauer法，最低藥物抑菌濃度(MIC)測定采用平皿雙倍稀釋法。諾氟沙星藥敏紙片購自浙江省軍區后勤部衛生防疫檢驗所。諾氟沙星標準品由浙江新昌制藥廠(chǎng)提供，批號：920807，效價(jià)99%。質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

　　三、PCR擴增gyr A基因N末端區

　　由于志賀菌在遺傳學(xué)上與大腸埃希菌相近，因此我們根據大腸埃希菌DNA旋轉酶(Gyrase)基因序列設計引物^［3］。PCR擴增片段位于gyr A基因24～671位點(diǎn)，PCR擴增產(chǎn)物為648bp。引物Ⅰ：5′-TACACCGGTCAACATTGAGG-3′，引物Ⅱ：5′-TTAATGATTGCCGCCGTCGG-3′。染色體DNA的提取見(jiàn)參考文獻［4］。100μl PCR混合液包括：10×PCR緩沖液10μl，25mmol/L MgCl₂ 7μl,20mmol/L dNTP 0.5μl,引物Ⅰ 100ng，引物Ⅱ100ng，Taq酶2.5u，模板DNA 50ng,加dH₂O至100μl。PCR條件：94°C預變性5分鐘。94°C 1分鐘，56°C 45秒，72°C 30秒，共35個(gè)循環(huán)。反應結束后72°C延伸10分鐘。PCR重復進(jìn)行2次，PCR所用引物及試劑均購自美國Promega公司。PCR儀為美國Perkin Elmer公司的PE480熱循環(huán)儀。

　　四、PCR產(chǎn)物克隆

　　使用美國Promega公司的pGEM-T Easy Vector SystemsⅠ進(jìn)行PCR擴增產(chǎn)物的克隆。連接反應包括：T4 DNA ligase 10×Buffer 1μl,pGEM-T Easy vector 1μl(50ng),PCR 產(chǎn)物 2μl(30ng),T4 DNA Ligase 1μl(3u),dH₂O 5μl,4°C過(guò)夜。感受態(tài)細胞為大腸埃希菌DH5α。將轉化細胞培養液均勻涂布在含有氨芐西林(50μg/ml)的麥康凱平板上，根據α-互補現象，37°C過(guò)夜后挑取白色單個(gè)菌落于LB液體培養基增菌后用堿法抽提質(zhì)粒。EcoRI單酶切進(jìn)行重組子的鑒定，轉化試驗及其他操作過(guò)程參見(jiàn)美國冷泉港實(shí)驗室出版的《分子克隆實(shí)驗指南》^［5］。

　　五、gyr A基因序列測定和分析

　　按照Sanger雙脫氧鏈末端終止法，使用美國Promega公司的Taq Track Sequencing Core System kit進(jìn)行測序反應，詳細過(guò)程參見(jiàn)使用手冊，測序反應和電泳重復2次。手動(dòng)測序儀為美國生命技術(shù)公司生產(chǎn)的GiBcoBRL sequencing Model S2 DNA測序儀，放射性同位素采用α-³²P dATP，購自北京亞輝生物醫學(xué)工程公司。

　　結果

　　一、生化與血清學(xué)鑒定

　　共分離志賀菌30株，均為福氏志賀菌，未見(jiàn)其他血清型。

　　二、抗菌藥物敏感試驗結果

　　30株福氏志賀菌中有16株對諾氟沙星耐藥，耐藥率達53.3%，對諾氟沙星的MIC范圍為0.25～128mg/L,MIC₅₀為32mg/L，MIC₉₀為32mg/L，用于gyr A基因測定的5株福氏志賀菌的MIC依次為32、64、32、32、0.25mg/L。紙片法與MIC的結果相符。

　　三、PCR反應產(chǎn)物的電泳結果

　　見(jiàn)圖1。

M：1kb分子量標準，1～4：耐藥菌，5：敏感菌，6：福氏志賀菌標準菌51573，C：空白對照圖1　0.7%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色

　　四、gyr A基因序列的聚丙烯酰胺凝膠電泳同位素放射性自顯影結果

　　見(jiàn)圖2。gyr A基因序列及相關(guān)氨基酸的結果見(jiàn)表1。敏感菌和標準菌的gyrA基因序列與國外報道的序列完全相同^［6］，與大腸埃希菌在氨基酸位點(diǎn)85及89上存在堿基變異但不引起氨基酸改變。

　　討論

　　諾氟沙星作為治療細菌性痢疾的藥物在初期取得了很好的療效，但隨著(zhù)這類(lèi)藥物使用的增多其耐藥性逐漸上升。本研究中我們在流行季節用不到1個(gè)月的時(shí)間里收集到的30株福氏志賀菌對諾氟沙星的耐藥率達到53.3%(16/30)。這數字較國內其它報道的結果相對較高^［7］，可能與我們收集菌株偏少且過(guò)于集中有關(guān)，有待于擴大樣本數量更廣泛地進(jìn)行流行病學(xué)的調查。細菌對氟喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥機制主要為三方面：(1) Gyrase基因點(diǎn)突變；(2)膜通透性下降；(3)主動(dòng)流出系統。其中gyr A基因發(fā)生點(diǎn)突變是造成細菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因^［8］。國外對氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥機制已有較多的研究，其中對gyr A基因點(diǎn)突變的研究最引人關(guān)注，研究已經(jīng)發(fā)現gyr A基因突變的位點(diǎn)集中發(fā)生在N末端核苷酸序列為199至318的一個(gè)小區間內，此區間已被公認為氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥決定區^［9］，并已發(fā)現在編碼氨基酸67、81、83、87、106等位點(diǎn)上的染色體DNA上出現導致氨基酸改變的堿基點(diǎn)突變。但這些研究大多集中于大腸埃希菌以及金黃色葡萄球菌等，對志賀菌的研究甚少。Horiuchi等^［10］在7株對氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感性下降的宋內志賀菌的研究中發(fā)現同位素¹⁴C標記的氧氟沙星在這些細菌內的蓄積與敏感菌相同，氧氟沙星對這些細菌DNA的合成抑制作用甚少，并通過(guò)體外DNA旋轉酶活性的研究推測這些細菌對氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感性下降是由于gyr A基因突變造成的。Rahman等^［6］發(fā)現痢疾志賀菌Ⅰ型對萘啶酸耐藥是由于gyr A基因氨基酸83位點(diǎn)上C→T堿基突變導致絲氨酸突變?yōu)榱涟彼嵩斐傻�。迄今為止，國內外關(guān)于福氏志賀菌對氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥機制的研究，目前作者尚未見(jiàn)有報道。

　　我們通過(guò)對gyr A基因序列的對比研究中首次發(fā)現在耐藥福氏志賀菌gyr A基因的83、87氨基酸位點(diǎn)上存在著(zhù)導致氨基酸改變的基因點(diǎn)突變。因此，我們認為這些臨床分離的福氏志賀菌對諾氟沙星產(chǎn)生耐藥性與gyr A基因的點(diǎn)突變有關(guān)，在這些耐藥菌中是否存在細菌膜對藥物的通透性下降或主動(dòng)流出系統尚待進(jìn)一步的研究。

　　作者單位：310003　杭州，浙江醫科大學(xué)附屬第一醫院(丁建強、吳仲文、馬亦林、龔正、陳亞崗)；浙江省余杭市第一醫院(王建華)

　　參考文獻

　　1　包幼迪，俞樹(shù)高，戴賡孫，等.痢疾桿菌耐藥性變異的研究.中華微生物和免疫學(xué)雜志，1982，2：304-307.

　　2　聶青和，張開(kāi)瑞，黃上媛，等.細菌性痢疾3018例的菌群分布與藥敏試驗.人民軍醫，1995，429：35-37.

　　3　Swanberg SL, WANG JC. Cloning and sequencing of the Escherichia coli gyr A gene coding for the A subunit of DNA gyrase. J Mol Biol, 1987, 197:729-736.

　　4　盧圣棟，主編.現代分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù).北京：高等教育出版社，1993.415-417.

　　5　金冬雁，黎孟楓，譯.分子克隆實(shí)驗指南.第二版，北京：科學(xué)出版社，1992.49-56.

　　6　Rahman. M, Mauff. G, Levy. J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyr A gene of shigella dysenteriae type 1 by PCR. J Antimicrob Chemother, 1994, 38:2488-2491.

　　7　孫殿興，李仕英，張福廣，等.1986～1995年629株痢疾桿菌菌型分布及藥敏調查.中華傳染病雜志，1997，15：172-174.

　　8　Lewin. CS, Allen RA, Amyes SGB. Potential mechanisms of resistance to the modern fluorinated 4-quinolones. J Med Microbiol, 1990, 31:153-161.

　　9　Yoshida H, Bogaki M, Nakamura M, et al. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyr A gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1990, 34:1271-1272.

　　10　Horiuchi S, Inagaki Y, Yamamoto N, et al. Reduced susceptibilities of shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. J Antimicrob Chemother, 1993, 37: 2486-2489.

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