淺論志賀菌耐多藥外排泵emrE基因作用

【摘要】  目的 對臨床耐多藥志賀菌株H24的1種小多重耐藥性家族(SMR)外排泵emrE基因進(jìn)行定向分子進(jìn)化，研究基因突變增強emrE外排泵耐藥性的潛力，調查志賀菌外排泵基因emrE基因垂直進(jìn)化對臨床耐藥發(fā)展的影響。 方法 通過(guò)用體外易錯PCR(EP-PCR)方法對emrE基因進(jìn)行隨機突變實(shí)驗，用微量稀釋生長(cháng)曲線(xiàn)法進(jìn)行菌株的耐藥性篩選，用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定基因表達情況，應用DNA分析軟件DNAStar進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結果 在31個(gè)突變子中篩選到了突變子ep2-emrE(DH5α)，它的emrE基因有6個(gè)氨基酸突變, 分別為Thr-28→Ala，Cys-39→Ser，Tyr-40→終止子， Ser-72→Arg，Leu-93→Phe，Ile-101→Phe。它不但增強四環(huán)素和紅霉素的耐藥能力，還產(chǎn)生新的氯霉素耐藥能力。結論盡管emrE基因較易獲得新增耐藥性，但在志賀菌對四環(huán)素、紅霉素等抗生素耐藥性發(fā)展中，emrE基因的進(jìn)化突變沒(méi)有被篩選，表明有其他能力更強的耐藥基因在突變進(jìn)化中起作用。

【關(guān)鍵詞】  志賀菌;耐藥性;emrE基因;分子進(jìn)化

Effect of genetically modified efflux pump emrE in isolated Shigella spp. WU Jian, MU Rui��rui, REN Cun��bang, et al.College of Public Health , Zhengzhou University(Zhengzhou 450001,China)

　　Abstract： Objective To study the potential gene mutation increasing the drug resistance ability of emrE efflux pump via genetic modification of the emrE gene from clinical isolated Shigella spp. strain H24, and to investigate the relationship between clinical drug resistance development of Shigella spp. and the vertical evolution of emrE efflux pump. Methods Gene emrE was mutated via error prone PCR.Drug resistance of the strain was determined by micro��dilution growth curve method.The expression of the genes was measured by fluorescent quantitative RT��PCR and the bioinformatics analysis was conducted by DNAStar. Results Among the 31 mutants, ep2��emrE showed the ability of increasing tetracycline and erythromycin resistance and the newly gained ability of chloromycetin resistance indicating the mutational potent of the gene. Conclusion Although it is easy for gene emrE to achieve new drug resistant ability, the mutation and vertical evolution of the emrE gene is not selected in the development of tetracycline and erythromycin resistance.So,there may be some more strong multidrug resistance genes and mutation.

　　Key words： Shigella spp.; drug resistance; emrE gene; molecular evolution

　　細菌的藥物外排作用是近10年發(fā)現的重要耐藥機制，它在細菌中廣泛存在〔1〕。一種外排泵可排出結構完全不相干的多種藥物，因而可造成耐多藥性。對大腸埃希菌基因組的調查顯示，至少存在37種外排泵，包括耐單藥和耐多藥外排泵，分屬5個(gè)外排泵家族〔2〕。耐多藥志賀菌H24的emrE外排泵是一種最簡(jiǎn)單的外排泵，屬于小多重耐藥性家族(small multidrug resistance, SMR)，也是一種研究最充分的耐多藥外排泵。它可以表達對一價(jià)陽(yáng)離子及親脂性陽(yáng)離子如紅霉素、磺胺噻唑鈉、四環(huán)素、磺胺嘧啶鈉、溴乙啶和結晶紫的耐藥性〔3〕。本研究通過(guò)體外隨機突變獲得突變體，對emrE基因垂直進(jìn)化進(jìn)行研究，獲得了耐藥功能增強和新的耐藥功能的突變基因，并探討了該基因的突變對細菌耐藥能力進(jìn)化的影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 (1)菌株：大腸埃希菌DH5α，臨床分離志賀菌耐多藥株H24(鄭州大學(xué)公共衛生學(xué)院流行病教研室收集保存); (2)載體：pMD18-T 載體(寶生物大連有限公司);(3)工具酶及試劑：SacⅠ內切酶、BamHⅠ內切酶、胰RNA酶、DNA 回收試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光擴增體系(寶生物大連有限公司);抗生素(中國藥品生物制品檢定所);酵母提取物和蛋白胨(英國Oxiod公司)。營(yíng)養肉湯水解酪蛋白培養基(MH)(北京奧博星公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 志賀菌H24基因組DNA提取 按文獻〔4〕方法進(jìn)行。

　　1.2.2 志賀菌臨床耐多藥株H24外排泵emrE 基因片段擴增按文獻〔5〕方法進(jìn)行。

　　1.2.3 易錯聚合酶鏈式反應(Error prone PCR,EP-PCR) EP-PCR使用的引物與擴增H24外排泵emrE 基因使用的引物相同〔5〕, 以用H24為模板擴增的emrE基因為模板。采用MgCl2 25 mmol/L，MnCl2 5 mmol/L EP-PCR反應體系, EP-PCR產(chǎn)物用DNA快速回收試劑盒回收。

　　1.2.4 序列測定 純化后的易錯emrE基因與pMD18-T 載體于16 ℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。利用藍白斑法篩選重組克隆;堿裂解法從菌液中提取質(zhì)粒，用SacⅠ單酶切及SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定emrE陽(yáng)性質(zhì)粒。驗證均為陽(yáng)性的質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

　　1.2.5 微量稀釋生長(cháng)曲線(xiàn)法測定菌株耐藥性 采用MH液體培養基, 在無(wú)菌操作下將倍比稀釋后不同濃度的抗生素溶液利福霉素、紅霉素、硫酸新霉素、鹽酸四環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星和鹽酸強力霉素分別加到滅菌的96孔板中，每孔10 μl，只加培養基作為陰性對照。0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1000稀釋后，向每孔中加100 μl，每個(gè)處理3個(gè)并行重復。置于37 ℃培養箱中震蕩培養，4 h后在酶標儀450 nm處測定菌體濃度吸光度(A)值，以后每隔3 h測1次A值, 結果取平均值。為防止染色體突變造成的假陽(yáng)性結果，所有重組菌株在測得耐藥性變化后，再提取質(zhì)粒重新轉化新的大腸埃希菌DH5ɑ菌株。如果再次測得同樣的耐藥性，則確認耐藥是由質(zhì)粒攜帶的外源突變基因引起的。

　　1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR 利用Primer 5.0設計引物，以大腸埃希菌內穩定表達的看家基因gapA 基因的380 bp片段作為內參，emrE基因內部的190 bp序列為目的序列，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。目的基因引物為GGGTTTACACGGTTATGGC和 GGGTTTACACGGTTATGGC，看家基因的引物為CTGGTCCGTCTAAAGACAACA和 ACGAACGGTCAGGTCAACTA。分別以對照株pMD(DH5α)和pMD-emrE(DH5α)及emrE基因突變重組株cDNA為模板，同時(shí)擴增emrE基因片段及甘油醛3-磷酸脫氫酶gapA 基因片段。熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用Rotor-Gene 3000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(澳大利亞 Corbett Research公司);采用SYBR Premix Ex TaqTM熒光擴增體系，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)并于60 ℃記錄熒光強度，然后測定熔解曲線(xiàn)。每個(gè)樣品重復做3管。通過(guò)Rotor-Gene 3000分析軟件，得到目的基因和看家基因的循環(huán)域值(Ct值)和熔解曲線(xiàn)，采用相對定量的Comparative Delta-delta Ct方法，得到目的基因相對的拷貝數。

　　1.3 生物信息學(xué)分析 肽鏈序列比對分析由DNASTAR Inc.的 DNAStar Lasergene軟件處理。

　　2 結 果

　　2.1 EP-PCR擴增(圖1) 經(jīng)過(guò)條件摸索和優(yōu)化，2次EP-PCR(epA,epB)擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均在約1100 bp處有一特異擴增條帶，分子量大小與預期擴增值相符。將EP-PCR擴增產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，并轉入DH5ɑ菌株進(jìn)行篩選，共得到31株重組株。提取質(zhì)粒酶切電泳檢測后，送樣測序。

　　注：M:DL2000 Marker; 1,2：epA-emrE; 3：epB-emrE。

　　圖1 EP-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析

　　2.2 菌株的耐藥性變化(圖2) 選用不同EP-PCR變異株 pMD- ep1-emrE(DH5ɑ)和pMD- ep2-emrE(DH5ɑ)，通過(guò)微量稀釋生長(cháng)曲線(xiàn)法測定這2株進(jìn)化菌株及出發(fā)基因對照株pMD-emrE(DH5ɑ)和空質(zhì)粒對照株pMD (DH5α)對利福霉素、紅霉素、硫酸新霉素、四環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星和強力霉素的耐藥性。從生長(cháng)曲線(xiàn)可以看出，pMD��ep2��emrE(DH5ɑ)菌株對四環(huán)素、紅霉素和氯霉素的抗性比含原始基因株pMD-emrE(DH5ɑ)增高，其中氯霉素為新獲得的耐藥性, 表明經(jīng)進(jìn)化突變的ep2-emrE基因外排活性增強。圖2 pMD-epl-emrE(DH5ɑ)和pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)耐藥性變化2.3
 重組菌株中EP-PCR emrE基因表達 為近一步確認突變基因的表達情況，對重組菌中emrE 基因的表達進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉錄分析。在溶解曲線(xiàn)中未檢測到引物二聚體和其他非特異性熒光信號。熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR獲得pMD(DH5a)、pMD-emrE(DH5ɑ)、pMD- ep1-emrE(DH5ɑ)、pMD- ep2-emrE(DH5ɑ)4個(gè)樣本的平均Ct值和mRNA相對表達量。其emrE基因的相對表達量分別為1，20300，23600和49000倍。ep2-emrE基因不但得到表達，而且它的mRNA表達量最高。

　　2.4 ep1-emrE、ep2-emrE的序列分析和氨基酸序列同源性比對 對原始emrE和突變基因ep1-emrE、ep2-emrE的DNA測序結果用DNASTAR 7.1.0軟件對3個(gè)基因序列進(jìn)行比對。結果顯示, 在開(kāi)放閱讀框內ep1-emrE有5個(gè)點(diǎn)突變，ep2-emrE有9個(gè)點(diǎn)突變。經(jīng)氨基酸同源性比較， ep1-emrE有5個(gè)氨基酸突變，分別是Glu-14→Gly, Met-21→Ile, Ile-54→Met, Ile-71→Asn, Trp-76→Arg;ep2-emrE有6個(gè)氨基酸突變, 分別是Thr-28→Ala，Cys-39→Ser，Tyr-40→終止子， Ser-72→Arg，Leu-93→Phe，Ile-101→Phe。ep2-emrE雖然Tyr-40突變成了UAA終止子，但從pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)的耐藥表現看，肽鏈合成并沒(méi)有被完全中止，UAA終止子可能被無(wú)義抑制子(nonsense suppressor)所抑制〔6〕。

　　3 討 論

　　本研究結果表明，在31個(gè)突變子中篩選出的突變子ep2-emrE，不但有增強的四環(huán)素和紅霉素耐藥能力，還有新產(chǎn)生的氯霉素耐藥能力, 顯示這種外排泵基因具有突變增強耐藥性的潛力。根據本研究前期結果〔5〕分析，本研究結果尚不能表明這種外排泵基因在臨床志賀菌對四環(huán)素、紅霉素等的耐藥性的發(fā)展中起著(zhù)重要作用。原因為：(1)通過(guò)對emrE基因的系統發(fā)育分析表明，它有很強的進(jìn)化規律和保守性，在不同種屬中有很強的歸屬性，與個(gè)體耐藥性無(wú)關(guān);(2)本實(shí)驗所用志賀菌H24是2002年在江西省銅鼓縣分離得到的臨床耐藥株，其emrE基因與20世紀50年代在北京分離的宋氏志賀菌Ss046基因序列竟然完全一致〔5〕，說(shuō)明50年來(lái)志賀菌紅霉素和四環(huán)素耐藥性的迅速發(fā)展與emrE基因突變沒(méi)有關(guān)系。

　　實(shí)驗結果表明，在細菌中有一個(gè)強大的耐藥基因武器庫，新的藥物環(huán)境會(huì )進(jìn)化篩選出新的改進(jìn)型耐藥基因。在志賀菌H24中，可能還有更強的紅霉素、四環(huán)素耐藥基因和耐藥突變在起作用。因此，象emrE基因這樣耐藥能力較弱基因的突變在臨床上未被篩選。在志賀菌中起作用的紅霉素、四環(huán)素耐藥基因還待進(jìn)一步研究。

作者：吳健  穆瑞瑞  任存邦  王春陽(yáng)  李玨  張衛東  范清堂  段廣才  

【參考文獻】
  　〔1〕 Piddock LJ.Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J].Clinical Microbiology Review,2006,19(2):382-402.

　　〔2〕 Nishino K,Yamaguchi A.Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli[J].J Bacteriol,2001,183 (20): 5803-5812.

　　〔3〕 Sharoni M,Steiner��Mordoch S,Schuldiner S.Exploring the binding domain of emrE,the smallest multidrug transporter[J].J Biol Chem,2005,280(38):32849-32855.

　　〔4〕 吳健，張少平，任存邦，等.志賀菌外排泵cmr基因克隆及耐藥作用[J].中國公共衛生,2007,23 (12): 1494-1495.

　　〔5〕 吳健,張少平，穆瑞瑞，等.志賀菌外排泵基因 emrE 的克隆表達及進(jìn)化分析[J].中國抗生素雜志，2007,32(10): 621-626.

　　〔6〕 Eggertsson G,S��ll D.Transfer ribonucleic acid��mediated suppression of termination codons in Escherichia coli[J].Microbiological Reviews,1988,52(3)：354-374.

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