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沙門(mén)氏菌病是公共衛生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門(mén)氏菌屬腸道細菌科，包括那些引起食物中毒，導致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)、爬行類(lèi)、魚(yú)、兩棲類(lèi)及昆蟲(chóng)。人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。
蛋、家禽和肉類(lèi)產(chǎn)品是沙門(mén)氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決于沙門(mén)氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體。根據國際慣例，要求對易受沙門(mén)氏菌污染的食品進(jìn)行分類(lèi)管理，以使大多數食物不含沙門(mén)氏菌，從而有效預防沙門(mén)氏菌病。為此，人們在探索沙門(mén)氏菌檢測方法的過(guò)程中，作出了不懈的努力，現將有關(guān)進(jìn)展報告如下，并介紹兩種快速檢測沙門(mén)氏菌的試劑盒。
自19世紀后期，沙門(mén)氏菌首次被鑒定為人類(lèi)的一種病原以來(lái)，檢測方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門(mén)氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應用在食品分析上。第一，通常，沙門(mén)氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì )干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過(guò)加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門(mén)氏菌受到了尚不致命的損傷或稱(chēng)“致傷”。這就形成了一個(gè)具有不同生長(cháng)特性的細菌群。這種現象對那些希望從食物樣品中分離出沙門(mén)氏菌的食品分析家來(lái)說(shuō)有很大影響，因為在選擇培養基上直接培養“致傷”的沙門(mén)氏菌通常是以細菌死亡和試驗失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟，專(zhuān)門(mén)針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時(shí)，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時(shí)、快速評價(jià)食品中微生物的安全性時(shí)，通常不被采用。隨著(zhù)DNA和抗體技術(shù)的發(fā)展，近10～15年間發(fā)展了無(wú)數改進(jìn)的方法，其中許多可以在48h內檢出沙門(mén)氏菌，這些方法通稱(chēng)為快速檢測。
1 傳統的培養方法
用于沙門(mén)氏菌分析的傳統方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟。第一步(預增菌)，將樣品加到一種高營(yíng)養、無(wú)選擇性的培養基中，溫度
2 以抗體為基礎的檢測方法
利用抗原-抗體反應的顯著(zhù)特異性，來(lái)進(jìn)行細菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個(gè)多世紀的歷史。細菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門(mén)氏菌免疫學(xué)檢測方法有許多種，大致可分為以酶標抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標記抗體(放射免疫試驗)為基礎的方法及其它多種以抗體為基礎，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散及免疫色譜技術(shù)的方法。但常規中最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎的方法。此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標記抗體，概括地說(shuō)，是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來(lái)捕捉目標抗原，經(jīng)洗滌除去未結合的成分，加入第二種酶標抗體，此者結合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上，第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應，然后用分光光度法即很容易檢測到目標抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應形式標準化，并促成其自動(dòng)化。
最近黎兆滾等人首次在國內口岸系統應用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)對進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚(yú)粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門(mén)氏菌檢測。該法采用預先包被了沙門(mén)氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應后再加入一定的指示劑，作用畢后用酶標儀測定OD值來(lái)判定結果。食物樣品經(jīng)適當的增菌處理，也可用此法進(jìn)行沙門(mén)氏菌檢測。
ELISA法檢出沙門(mén)氏菌的極限范圍在105～106個(gè)細胞/ml，因此，要得出可靠的結果，食物樣品首先必需進(jìn)行預增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進(jìn)行后增菌，以促進(jìn)鞭毛發(fā)育�？偟膩�(lái)說(shuō)，標準的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過(guò)40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)樣品制備過(guò)程分三步，共耗時(shí)24h：①選用營(yíng)養肉湯進(jìn)行預增菌(6h)，使“致傷”、冷凍的沙門(mén)氏菌復蘇。②使用選擇性培養基RV進(jìn)行增菌(14h)，使沙門(mén)氏菌大量繁殖，同時(shí)抑制其它雜菌生長(cháng)。③使用營(yíng)養肉湯(蛋白胨水)進(jìn)行后增菌(4h)，使沙門(mén)氏菌的數量大大增加。比上述標準的ELISA法樣品制備過(guò)程縮短了一半的時(shí)間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時(shí)間，90min是孵育時(shí)間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內完成，比上述方法縮短了一半的時(shí)間，頗值得推廣應用。
最新式的沙門(mén)氏菌免疫學(xué)檢測法，利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎。幾滴樣品加到卡片上，結果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無(wú)需要特殊設備，很適合小型實(shí)驗室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進(jìn)行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時(shí)不超過(guò)10min，如果采用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時(shí)間更為縮短。
3 以核酸為基礎的方法
細胞核酸DNA和RNA是唯一一類(lèi)可以攜帶信息的大分子。由于所有的細胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測的標靶。標靶通常是一個(gè)特異性核酸序列，它可通過(guò)以補體核酸分子作為探針來(lái)檢出。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要加附適當的標記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標識物。Fitts等人在食品沙門(mén)氏菌檢測中引入了第一代DAN—RNA雜交技術(shù)，此法應用的探針含有用放射性同位素標記的傷寒沙門(mén)氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48h的增菌步驟后，檢測極限可達108個(gè)細菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗室應用，此方法的優(yōu)點(diǎn)都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎的第二代技術(shù)—比色計目前已發(fā)展起來(lái)。這種方法依賴(lài)于沙門(mén)氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發(fā)育過(guò)程中儲存的核酸成分的檢測。核糖體是細胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個(gè)細菌細胞中存在5000～20 000個(gè)復制體，而相比之下染色體DNA復制體僅2～10個(gè)。這種天然富含rRNA標靶序列的情況使得用無(wú)輻射計檢測成為可能，同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當或更高的敏感性。其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無(wú)需經(jīng)過(guò)變性步驟。要得到陽(yáng)性結果，此法需要105個(gè)靶細胞/ml，因此對沙門(mén)氏菌檢測來(lái)說(shuō)，需要進(jìn)行預增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針?lè )ū壬抽T(mén)氏菌ELISA法更耗時(shí)，但二者成本相近。
食品細菌檢測法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴增體系方面的發(fā)展，即聚合酶鏈反應(PCR)，用該體系可對制備好的樣品進(jìn)行細菌DNA擴增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用于檢測沙門(mén)氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動(dòng)化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測反應的某些成分。一個(gè)完整的以PCR為基礎的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷(xiāo)了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但這種方法對那些含沙門(mén)氏菌較少或沙門(mén)氏菌“致傷”嚴重難以復蘇而仍保有沙門(mén)氏菌rRNA的樣品尤其有效。
盡管目前用來(lái)檢測沙門(mén)氏菌的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但隨著(zhù)科學(xué)發(fā)展，技術(shù)進(jìn)步，人們探索、實(shí)踐的繼續深入，我們可以期待，將會(huì )有更多，敏感性更高，特異性更強，診斷時(shí)間更短的新方法出現。
4 兩種沙門(mén)氏菌快速檢測法
4.1 Transia沙門(mén)氏菌平板檢測法 與耗時(shí)、昂貴的傳統方法相比，此法快1～2天，且每次檢測所需的操作時(shí)間縮短。該法建立在夾心ELISA法的基礎上，利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門(mén)氏菌血清型。反應的固相載體是一種有可見(jiàn)或不可見(jiàn)條紋的微量反應板。其小孔內包被有沙門(mén)氏菌的特異性單克隆抗體。
第一階段，在小孔內加入樣品和抗體聯(lián)合物(沙門(mén)氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物)。孵育期間，沙門(mén)氏菌抗原和包被抗體形成了一種復合物：包被單克隆抗體-沙門(mén)氏菌抗原-抗體聯(lián)合物。洗滌后，通過(guò)每孔加入基質(zhì)溶液(過(guò)氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)來(lái)顯示上述復合物；酶催化色素原的氧化，結果產(chǎn)生藍色。加入反應終止液終止催化反應，并使反應混合物酸化，顏色由藍變黃。
這種ELISA方法可對經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后，釋放了特異性沙門(mén)氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進(jìn)行檢測。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可大大縮短檢測時(shí)間；此法可在沒(méi)有酶標儀的實(shí)驗室進(jìn)行，從這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，Transia沙門(mén)氏菌平板檢測法比黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更適應于一般的實(shí)驗室使用。
4.2 Transia沙門(mén)氏菌卡片檢測法 此法以單步免疫反應即夾心型免疫色譜反應為基礎。反應固相包括一塊用“抗沙門(mén)氏菌抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條，抗沙門(mén)氏菌抗體就固定在薄膜的反應區上。增菌后，增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內并令其吸收，如樣品存在沙門(mén)氏菌抗原，它們會(huì )與偶合物作用，然后依次遷移到膜上，與固定在膜上反應區的抗體結合，在反應窗上呈現一條色帶。最后結果可在5～7min內讀取。此法也適用于沒(méi)有酶標儀的實(shí)驗室。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可更加縮短檢測時(shí)間，可在普通實(shí)驗室條件下進(jìn)行。
作者單位：彭麗萍:黃埔動(dòng)植物檢疫局(廣州，510700)
陳博文 徐建超 劉中勇:廣州動(dòng)植物檢疫局
參考文獻
1.黎兆滾，陳博文,等.用ELISA法快速檢測沙門(mén)氏菌.中國進(jìn)出境動(dòng)植檢,1997，(3)：34.
2.Frank Axelsson,Marie-laure Sorin.Transia Salmonella technical handbook 1997,16～22.Backa bergogata 5,S-422 46 Hisings Backa,Sweden.
3.Kevin Engler.Salmonellosis in laboratry animals.NAL.SRB 89-01,October 1988,1～2.National agricultural Libraty,Beltsville,MD20705.Animal Welfare Information Center (AWIC).(301)344～3212.
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