白念珠菌對氟康唑耐藥性的研究

摘　要　目的：探討白念珠菌對氟康唑耐藥性的產(chǎn)生是否有適應性突變的因素。方法：選擇對氟康唑敏感的白念珠菌野生Y0109株，將其在含8 μg/ml氟康唑的沙堡固體培養基上進(jìn)行漂移試驗誘導培養，計數其生長(cháng)出的菌落并根據Cairns的理論進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。結果和結論：擬合出的曲線(xiàn)基本符合Poisson曲線(xiàn)分布特點(diǎn)，根據Cairns的適應性突變理論及判定方法，初步證實(shí)白念珠菌對氟康唑耐藥主要是因藥物本身的后天誘導作用，使該敏感白念珠菌發(fā)生了適應性突變而成為耐藥菌株。

　　關(guān)鍵詞：念珠菌，白色　氟康唑　突變　藥物耐受性

　　目前，臨床致病菌的耐藥問(wèn)題是人類(lèi)所面臨的醫學(xué)難題之一。近年來(lái)隨著(zhù)真菌感染患者的增多及抗真菌藥物應用的頻繁，真菌耐藥現象也越來(lái)越普遍。最常見(jiàn)的致病真菌為白念珠菌，而白念珠菌耐氟康唑為最常見(jiàn)的真菌耐藥現象^［1］。在臨床治療同一艾滋病患者念珠菌性口炎時(shí)，所需氟康唑劑量需逐漸增大，菌的耐藥水平也逐漸增大，而菌株并沒(méi)有改變^［2］。對耐藥菌的出現，人們通常習慣認為是抗生素殺死了敏感菌，而將耐藥的菌群亞株選出來(lái)，即耐藥株是先天存在的，而非后天的適應性改變。較早涉及研究微生物是否有適應現象這個(gè)問(wèn)題的是Luria和Delbrück；Cairns等^［3］在1988年通過(guò)大腸桿菌Lac^-株利用乳糖的漂移試驗，提出了適應性突變理論。本實(shí)驗就目前臨床最常見(jiàn)的真菌耐藥現象——白念珠菌對氟康唑耐藥性的來(lái)源作一初步研究。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　白念珠菌Y0109株，為標準敏感野生株，對氟康唑敏感，用NCCLS(the National Committee for Clinical Laboratory Standards)方法測得耐藥值小于0.5 μg/ml；白念珠菌Y0119株，為標準耐藥株，對氟康唑耐藥，用NCCLS方法測得耐藥值大于32.0 μg/ml；以上菌株均由中國醫學(xué)科學(xué)院皮膚病防治研究所提供。氟康唑粉劑由第二軍醫大學(xué)藥學(xué)院有機化學(xué)教研室提供，用生理鹽水溶解制成800 μg/ml母液備用。培養基選用不含任何藥物的沙堡液體培養基和沙堡固體培養基（即空白培養基），及含氟康唑8 μg/ml的沙堡固體培養基。

　　1.2　方法

　　1.2.1　原理　根據Cairns所述理論^［3］，如白念珠菌敏感株Y0109株在含藥培養皿上長(cháng)出的耐藥株只是其中先天就耐受氟康唑的亞株，則其在數個(gè)同樣培養皿中生長(cháng)出的耐藥菌落數目應符合Delbrück曲線(xiàn)分布特點(diǎn)。 如在含藥平皿上長(cháng)出的耐藥菌落全為后天適應性突變而產(chǎn)生耐藥的，則長(cháng)出的菌落數目分布應符合Poisson曲線(xiàn)分布特點(diǎn)。如與先天遺傳及和后天適應性突變均有關(guān)，則為兩者復合圖形。

　　1.2.2　Y0109株氟康唑誘導培養及菌落計數　將Y0109株在空白固體沙堡培養基上培養24 h后，挑取1個(gè)單菌落（以保證菌為單克隆菌），用注射用水制成混懸液后，平均分至11個(gè)含10 ml液體沙堡培養基大試管中，培養48 h，檢測菌濃增殖到(2～3)×10⁷ cfu/ml時(shí) ，用振蕩器將其振蕩15 min搖勻，每管涂10個(gè)平皿，每個(gè)平皿用0.5 ml（每個(gè)平皿中含10 ml固體沙堡培養基，含氟康唑濃度為8 μg/ml），第11號管為空白固體沙堡培養基對照。給每個(gè)平皿編號。每隔24 h計數所能觀(guān)察到的新生菌落數，共觀(guān)察10 d，直至沒(méi)有新生菌落產(chǎn)生。共涂布培養皿112個(gè)（包括第11只管只涂2個(gè)空白培養基作對照）。

　　1.2.3　各株菌在無(wú)藥情況下生成菌落的速度　將敏感菌株Y0109株、標準耐藥株Y0119株及誘導出的耐藥株分別在不同試驗室用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)�連續振蕩15 min，制成均勻混懸液，菌量調至(2～3)×10⁴ cfu/ml，均用0.5 ml菌液涂布空白固體沙堡培養基上，每組10個(gè)平皿，各組取平均值。

　　1.2.4　各株菌在氟康唑固體沙堡培養基上菌落生成速度　除培養基由空白換成含氟康唑8 μg/ml外，余材料及操作同上。

　　1.2.5　敏感菌株中先天耐藥菌數目檢測　用含菌4×10⁷ cfu/ml的Y0109株菌混懸液（制備方法同上）0.5 ml涂布到含氟康唑8 μg/ml固體沙堡培養基上，共10個(gè)平皿，觀(guān)察24 h。用臨床耐藥株Y0109株做如上操作作為對照（在不同實(shí)驗室）。

　　1.2.6　在含藥8 μg/ml固體沙堡培養基白念珠菌的活力保持　絕大多數白念珠菌不能發(fā)生突變而長(cháng)不成菌落，但仍有活力。第10天時(shí)，在培養皿（注意保持濕度，在100個(gè)含藥誘導培養平皿中隨機選擇10個(gè)）沒(méi)有長(cháng)出菌落的部位盲涂轉種到2個(gè)空白培養基上，并同時(shí)轉種1個(gè)含藥培養基（含氟康唑8μg/ml）作對照。

　　2　結　果

　　2.1　標準敏感株誘導培養后菌落數　在誘導培養過(guò)程中，空白對照平皿24 h后菌落就已密布平皿，含藥的平皿在72 h后才出現單個(gè)菌落。觀(guān)察7 d后才無(wú)新的可見(jiàn)菌落生成。在100個(gè)含藥平皿中，平均每個(gè)平皿長(cháng)出的耐藥菌落數目為m=52.35（16～157）。以10 為組距，分組后統計各組的頻數，取各組上下限的均數計算頻數及相應均數的常用對數值，參照Cairns的理論圖形格式進(jìn)行繪圖(圖1，曲線(xiàn)a)。

圖1�。�略）　　根據Cairns理論，在m=52.35,n=100情況下，利用公式P(X)=e^-μμ^x/X！, P(X)其中為發(fā)生X次突變的理論頻數,e為自然底數，μ為總體均數(實(shí)際運算中以平均突變數m代替)，X！代表X的階乘，其推導出的Poisson曲線(xiàn)為曲線(xiàn)b。

　　根據Delbrück的自由突變理論及公式^2］推導出的圖形為曲線(xiàn)c。P_r為發(fā)生r次突變的概率，為應該發(fā)生j次突變而實(shí)際發(fā)生了r次突變的樣本數，m為實(shí)際發(fā)生突變的均數。

　　從圖1曲線(xiàn)a與b圖形形狀看，具有近似性；而與圖中 Delbrück曲線(xiàn)c圖形相差甚遠。由此可以推論:白念珠菌對氟康唑耐藥主要是因后天氟康唑誘導作用，即主要是因為白念珠菌對氟康唑的抑制作用發(fā)生了適應性突變所致。但曲線(xiàn)a仍有少許拖尾現象，即這個(gè)圖形是一個(gè)復合圖形，故考慮不排除先天耐藥成分，即自然突變導致耐藥成分的存在。

　　2.2　耐藥菌與敏感株菌在空白沙堡培養基菌落生成速度比較　各菌株觀(guān)察時(shí)間、計數見(jiàn)表1。

表1　各菌株菌落生成數目比較

　　Tab 1　Contrast the colonial number of

　　each fungus strain

　　以上數據經(jīng)過(guò)如下修正：各數據除以相應的初始接種濃度，以校正因接種濃度不同所引起的誤差。結果經(jīng)方差分析兩兩比較檢驗，證明無(wú)顯著(zhù)差異，即各菌株生成菌落數目無(wú)差異；因觀(guān)察時(shí)間相同，故考慮各菌株菌落生成速度也無(wú)顯著(zhù)差異（不包括敏感菌對照資料）。

　　2.3　敏感株中先天耐藥菌比例　將 4×10⁷ cfu/ml Y0109株菌0.5 ml接種到含氟康唑8 μg/ml固體沙堡培養基上，共10個(gè)平皿，觀(guān)察24 h，未見(jiàn)明顯菌落，在72 h后漸出現菌落。而用臨床耐藥菌Y0119株所做的10個(gè)對照平皿在12 h即有菌落出現，24 h后就密布平皿。

　　2.4　含藥平皿上敏感菌活力保持時(shí)間　在轉種的20個(gè)空白培養基中，經(jīng)24 h后均長(cháng)出菌落，而10個(gè)含藥對照平皿培養7 d后仍未見(jiàn)有菌落形成。

　　3　討　論

　　本實(shí)驗在標準敏感株誘導培養計數菌落過(guò)程中，只發(fā)現有3個(gè)較大菌落，且出現在培養72 h后；沒(méi)有發(fā)現在早期同時(shí)出現多個(gè)菌落的組。用耐藥菌所做的對照顯示，耐藥菌在含藥平皿上與敏感菌在空白平皿上生成菌落的速度具有一致性，也產(chǎn)生大小類(lèi)似的菌落；即使耐藥株經(jīng)過(guò)了空白平皿的培養傳代，這一性質(zhì)也不會(huì )改變。事實(shí)上，我們將誘導出的耐藥菌與敏感菌做這一對照試驗時(shí)也驗證了這一點(diǎn)。另外，如實(shí)驗所示用0.5 ml 10⁷ cfu/ml敏感菌菌量，在8 μg/ml平皿上培養24 h并無(wú)可見(jiàn)菌落出現，而用白念珠菌耐藥株Y0119株在含有相同濃度藥物的平皿上所做的對照，生長(cháng)出的菌落在24 h內已經(jīng)密布平皿，這說(shuō)明在敏感株中因自然突變而導致的耐藥性是很低的。

　　如是在接觸藥物后發(fā)生的突變，即藥物誘導出來(lái)的突變，則由于誘導培養環(huán)境相似，則各培養皿長(cháng)出的耐藥菌落在時(shí)間、大小、數目上應有近似性。正如圖1所示，圖形屬于Poisson 和Delbrück這兩種曲線(xiàn)的合并，但主要以Poisson圖形為主。也就是說(shuō)，耐藥株的產(chǎn)生以后天誘導為主。這就從理論上初步驗證了誘導耐藥現象的存在，即耐藥的出現與菌對藥物的適應性突變有重要關(guān)系；白念珠菌在氟康唑的藥物作用下會(huì )發(fā)生適應性突變，導致耐藥。

　　根據所接種的菌量（約為1.2×10⁷ cfu）與平均產(chǎn)生的突變菌落數（約為50個(gè)），加之在固體平板上，且產(chǎn)生的菌落相距較遠，故可基本排除接觸藥物后會(huì )有“互飼”及耐藥基因的傳遞而影響實(shí)驗結果，即一個(gè)耐藥菌落就代表一個(gè)敏感菌（及其所長(cháng)出而未脫落的芽）突變成耐藥菌。

　　在含藥的誘導培養基上，只要是耐藥菌，藥物并不能影響其菌落形成速度；即先天耐藥菌不會(huì )因遲滯生長(cháng)而與誘導出的耐藥菌相混同，也不會(huì )因生長(cháng)遲緩而引起計數誤差。

　　氟康唑在沙堡培養基中濃度為8 μg/ml時(shí)只是抑菌,即使是敏感菌也可在其上存活較長(cháng)時(shí)間（大于10 d）；白念珠菌在被抑制的環(huán)境中發(fā)生了適應性突變。因此，測菌的MIC必須用標準統一的方案。

　　根據本實(shí)驗數據所繪制的曲線(xiàn)與Poisson曲線(xiàn)有差異，除不能排除自然突變因素外，還可能有以下因素：（1）計數菌落誤差，對個(gè)別較小菌落有漏計或重計；（2）接種量誤差，此有待統計學(xué)校正；（3）菌自然凋亡而不能生成菌落。

　　總之，本實(shí)驗可以為臨床醫生正確使用抗生素提供理論依據，從而確認所謂“小劑量預防用藥”是錯誤的，提示濫用抗生素是極其危險的——極有可能給人類(lèi)帶來(lái)耐藥菌。

　　作者簡(jiǎn)介：梁曉博，男，1967年7月生，博士生

　　作者單位：第二軍醫大學(xué)長(cháng)征醫院皮膚科，上海，200003

　　參考文獻

　　1　廖萬(wàn)清， 吳紹熙. 中國致病真菌流行病學(xué)動(dòng)態(tài)研究.見(jiàn)：廖萬(wàn)清 主編. 真菌病學(xué)研究進(jìn)展［M］. 上海：第二軍醫大學(xué)出版社，1998.1～10

　　2　White TC. Increased RNA levels of ERG16, CDR and MDR1 correlate with increases in azole resistance in candida albicans isolates from a patients infected human immunodeficiency virus［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(7):1482

　　3　Cairns J, Overbaugh J, Meller S. The origin of mutants［J］. Nature ,1988,335(8): 142

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