奇異變形桿菌潛生體與繁殖體的耐藥性差異及其機制探討

摘　要　目的：觀(guān)察奇異變形桿菌潛生體與繁殖體的耐藥性差異并探討其發(fā)生機制。方法：采用一株自己構建的標準產(chǎn)酶菌株和一株臨床分離菌株，經(jīng)波動(dòng)培養法誘導產(chǎn)生潛生體及繁殖體，檢測二者的耐藥性差異，并通過(guò)β-內酰胺酶活性分析、外膜通透率測定及外膜蛋白SDS-PAGE檢測來(lái)探討其發(fā)生機制。結果：潛生體的耐藥程度普遍高于繁殖體，二者的β-內酰胺酶活性差異不顯著(zhù)(P＞0.05)，潛生體外膜通透率降低且有多種外膜蛋白減少或缺失。結論：外膜蛋白的大面積減少或缺失對潛生體耐藥程度的提高可能起著(zhù)重要作用。

　　關(guān)鍵詞：奇異變形桿菌　潛生體　繁殖體　耐藥性

　　奇異變形桿菌在固體培養基上生長(cháng)或感染組織時(shí)，形態(tài)上會(huì )出現纖細狀長(cháng)條菌與短桿菌之間的交替變化^［1］，國外一般將其命名為Swarmmer細胞及Swimmer細胞，國內也有研究者依據Swarmmer細胞及Swimmer細胞的生物學(xué)特性，將它們分別命名為潛生體(Cryptic growth cells, CGC)及繁殖體(Vegetative cells, VC)^［2］。本研究采用了兩株不同的奇異變形桿菌標準菌株，在特定培養條件下誘導產(chǎn)生潛生體和繁殖體，對二者的耐藥性進(jìn)行了比較，旨在初步探討這種耐藥性差異的存在與否及其發(fā)生機制。

　　1　材料與方法

　　1.1　主要藥品與試劑

　　青霉素G(PenicillinG, PCG)，氨芐西林(Ampicillin,AMP)，頭孢噻吩(Cephalothin, CPT)，頭孢孟多(Cefamandole,CMD)，四環(huán)素(Tetracycline,TC)，均由上海第三制藥廠(chǎng)生產(chǎn)。氯霉素(Chloramphenical,CP)，南京第一制藥廠(chǎng)產(chǎn)品。諾氟沙星(Norfloxacin,NFLX)，太原制藥廠(chǎng)產(chǎn)品。

　　丙烯酰胺，Serva產(chǎn)品。N，N′-亞甲雙丙烯酰胺，Fluka產(chǎn)品，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)和過(guò)硫酸胺均為E Merck產(chǎn)品。十二烷基硫酸鈉(SDS)，Sigma產(chǎn)品。中分子量標準蛋白質(zhì)，中科院上海生化所產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)AR級。

　　1.2　儀器與設備

　　DU-7紫外分光光度計，JA-21高速低溫離心機，Beckman公司產(chǎn)品。Gene Pulsar^TM電穿孔儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品。UR-200P超聲破碎儀，日本Tomy Seiko公司產(chǎn)品。

　　1.3　菌株及培養基

　　1.3.1　標準產(chǎn)酶菌株P.mirabilis VIr的構建　　奇異變形桿菌P.mirabilis VI由本室保存，耐藥質(zhì)粒P^MD101由德國達木土塔微生物研究所Martin教授惠贈。P^MD101經(jīng)高壓電穿孔法導入P.mirabilis VI構建成標準產(chǎn)酶菌株P.mirabilis VIr，產(chǎn)β-內酰胺酶AmpC。構建的新菌經(jīng)抗性篩選、尿素酶試驗、吲哚試驗等生化試驗及藥敏試驗和棒酸抑制試驗鑒定后用于本實(shí)驗。

　　1.3.2　奇異變形桿菌臨床分離菌株106 s　　由第三軍醫大學(xué)第二附屬醫院檢驗科分離鑒定，編號為106，對本實(shí)驗中采用的各種抗生素均敏感。

　　1.3.3　波動(dòng)Ⅰ號平板　胰蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，氯化鈉1%，氯化三苯基四氮唑(TTC)0.01%，葡萄糖0.1%，TTC及葡萄糖于倒平板前加。

　　1.4　細菌潛生體及繁殖體的制備^［3］

　　將形態(tài)均一的短桿狀奇異變形桿菌點(diǎn)種于波動(dòng)Ⅰ號平板中心，置每2h在34℃～39℃波動(dòng)一個(gè)周期的孵箱中培養18～24 h，待平板上出現紅、黃交替的細菌環(huán)后，取紅環(huán)細菌即得繁殖體，取黃環(huán)細菌即得潛生體。

　　1.5　最低抑菌濃度(MIC)的測定

　　采用試管二倍稀釋法，細菌終濃度取10⁵CFU/ml,18～24 h后觀(guān)察結果，MIC測定均重復3次。

　　1.6　β-內酰胺酶制備及活性測定

　　從波動(dòng)平板上分別收集細菌潛生體和繁殖體，于冰水浴中超聲破碎，裂解液于4℃，20000 g條件下超速離心1h，上清液即為粗酶液。以APC為底物，37℃條件下記錄單位時(shí)間內APC在204 nm處的吸光度變化，計算酶活性。酶活性單位為每毫克蛋白酶在37℃，pH7.0條件下，每分鐘水解APC的納摩爾數。酶活性測定均重復3次。

　　1.7　外膜通透性的測定

　　根據文獻［4］報道方法略加改進(jìn)。將潛生體及繁殖體細胞用pH7.0 PBS緩沖液洗滌2次后，將菌體重新懸浮于PBS中，制成D₆₀₀=0.55的細菌懸液。加入一定濃度APC溶液，此時(shí)取出0 min樣品，離心取上清液，用紫外分光光度計于204 nm處測定上清液中抗生素含量。余下的菌懸液置37℃恒溫搖床上放置30 min后，再測定上清液中抗生素含量。前后兩次測定結果比較，以細菌細胞對抗生素的吸收率代表細菌的外膜通透率。

　　1.8　外膜蛋白提取及電泳

　　相同濁度的潛生體及繁殖體菌懸液于冰水浴條件下超聲破碎，5000 r/min離心15 min以除去未破碎細胞。上清液于4℃，40000 r/min離心40 min得細胞膜沉淀，加入終濃度為1%的十二烷基肌氨酸鈉，室溫放置30 min，溶解內膜，經(jīng)16400 r/min，室溫離心40 min得外膜沉淀，沉淀外膜蛋白用pH7.0 PBS懸浮，加0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟置-70℃保存^［5］。

　　SDS-PAGE按文獻［6］方法進(jìn)行。

　　2　結果

　　2.1　奇異變形桿菌的潛生體與繁殖體

　　將奇異變形桿菌點(diǎn)種于波動(dòng)Ⅰ號平板中心，24 h后平板上出現紅、黃交替的細菌環(huán)，紅環(huán)上的短小桿菌即繁殖體，黃環(huán)上的纖細狀長(cháng)條菌即潛生體。

　　2.2　潛生體與繁殖體MIC比較，見(jiàn)表1

表1　奇異變形桿菌潛生體與繁殖體的MIC

　　tab 1　The MIC of cryptic-growth cells and vegetative cells of P.mirabilis

　　由表1可看出，潛生體MIC普遍高于繁殖體，差異程度為2～8倍不等。2.3　潛生體與繁殖體的β-內酰胺酶活性比較

　　β-內酰胺酶活性測定結果顯示，P.mirabilis潛生體與繁殖體酶活性分別為1220±55.1和1200±32.5，P.mirabilis 106 s潛生體與繁殖體酶活性為22±7.94和27.7±6.66，經(jīng)Newman-Keuls法檢驗，兩個(gè)菌株的潛生體及繁殖體之間β-內酰胺酶活性均差異不顯著(zhù)(P＞0.05)。

　　2.4　潛生體與繁殖體的外膜通透性

　　外膜通透性檢測結果顯示，P.mirabilis VIr及P.mirabilis 106 s繁殖體外膜通透率為56.2%和62.4%，而二者潛生體的外膜通透率則僅為31.6%和27.4%，潛生體的外膜通透性較之繁殖體有較大幅度的減低。

　　2.5　SDS-PAGE檢測外膜蛋白

　　對P.mirabilis VIr及P.mirabilis 106 s的潛生體、繁殖體外膜蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE檢測，電泳之前，將外膜蛋白樣品置于1×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱3min使蛋白質(zhì)變性，凝膠電泳結果見(jiàn)圖1。

圖（略）　　

　　從圖1中可看出，P.mirabilis VIr及P.mirabilis 106 s菌株中，潛生體除位于(34～38)×10³u的蛋白帶與每殖體含量大致相同外(38×10³u蛋白帶還略有增加)，其余各蛋白帶僅隱約可見(jiàn)，含量明顯低于繁殖體，表現為外膜蛋白的大面積減少。

　　3　討論

　　已有研究表明^［7］，奇異變形桿菌所導致的感染特別是上尿路感染與潛生體細胞的出現有密切關(guān)系，同時(shí)，有潛生體細胞存在的感染往往更為嚴重，在治療上也更為困難。這一方面是由于潛生體細胞的鞭毛數量、尿素酶、苯丙氨酸脫氨酶及溶血素的產(chǎn)生量都大大多于繁殖體，毒力較強^［8］；另一方面，也可能存在潛生體與繁殖體耐藥性差異上的原因。本實(shí)驗結果顯示潛生體細胞對本實(shí)驗中所采用的各種抗生素的MIC值普遍高于繁殖體，表明這種耐藥性差異是存在的。

　　關(guān)于革蘭氏陰性菌的耐藥機制，普遍認為主要涉及滅活酶的產(chǎn)生及外膜通透性?xún)蓚�(gè)方面^［9］。本研究選取了β-內酰胺酶作為滅活酶的代表，對產(chǎn)AmpC β-內酰胺酶的標準耐藥菌株P.mirabilis VIr及敏感菌株P.mirabilis 106 s中潛生體、繁殖體的β-內酰胺酶活性進(jìn)行了比較，結果差異并不顯著(zhù)(P＞0.05)，提示β-內酰胺酶等滅活酶的產(chǎn)生可能在潛生體與繁殖體間耐藥差異的發(fā)生中不起主要作用。在對潛生體與繁殖體外膜通透率的比較中，發(fā)現潛生體外膜通透率明顯低于繁殖體，進(jìn)一步進(jìn)行外膜蛋白的提取與電泳發(fā)現，兩個(gè)實(shí)驗菌株的潛生體細胞較之繁殖體細胞有大面積的外膜蛋白表達減少或缺失。已有研究表明，革蘭氏陰性菌外膜蛋白中的膜孔蛋白(Porins)是許多物質(zhì)包括抗生素進(jìn)入胞內的重要通道，外膜蛋白的減少或缺失可能是膜孔蛋白的減少或缺失，從而使外膜通透率降低^［10］。此外，外膜蛋白的減少或缺失也可能影響除膜孔蛋白以外的其他類(lèi)型的蛋白構成，從而影響膜通透性。本實(shí)驗中發(fā)現潛生體細胞對多種抗生素的MIC值均有不同程度的上升，這很可能與潛生體細胞中外膜蛋白的大面積減少或缺失有著(zhù)密切關(guān)系，因為減少或缺失的外膜蛋白中既可能包含了多種膜孔蛋白，也可能影響了其他類(lèi)型的蛋白構成，表現出一種非特異性的耐藥程度提高。

　　奇異變形桿菌潛生體耐藥程度普遍高于繁殖體且二者之間可相互轉化的特性，很可能是奇異變形桿菌機會(huì )致病及導致慢性尿路感染的機制之一。當奇異變形桿菌處于營(yíng)養缺乏的環(huán)境或應用了抗生素的條件下時(shí)，它很可能主要以潛生體細胞的形式存在，以一種代償性代謝轉變(如外膜蛋白的減少或缺失，合成鞭毛能力大大增強等)、抵抗力增強的方式存在，從而生存下來(lái)并導致疾病的發(fā)生。

　　國家自然科學(xué)基金資助項目，No.39370008

　　作者單位：黃春基　徐啟旺　叢延廣　第三軍醫大學(xué)生物波研究中心　重慶，400038

　　解曉珍　附屬新橋醫院檢驗科　重慶，400037

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