微量稀釋法對腫瘤患者術(shù)后合并感染ESBLs菌株的檢測驗證

摘　要　目的：用新型微量稀釋法對腫瘤患者術(shù)后合并感染超廣譜β－內酰胺酶菌株進(jìn)行檢測驗證。方法：雙紙片法初試微量稀釋法驗證，對27株肺炎克雷伯氏菌和32株大腸埃希氏菌進(jìn)行超廣譜β－內酰胺酶（Extended－Spectrum－Lactamases,簡(jiǎn)稱(chēng)ESBLs）檢測。結果：顯示肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌ESBLs攜帶率分別為14.8％(4/27)和9.4％(3/32)。結論：微量稀釋法是一種新型的驗證方法，不但可以測ESBLs，還可以同時(shí)測多種頭孢三代類(lèi)抗生素的MIC，具有不易漏檢，重復性好，準確，操作簡(jiǎn)便，終點(diǎn)易于判斷的優(yōu)點(diǎn)。

　　關(guān)鍵詞：超廣譜β－內酰胺酶　雙紙片法　微量稀釋法　肺炎克雷伯氏菌　大腸埃希氏菌

　　由質(zhì)粒介導的超廣譜β－內酰胺酶（Extended－Spectrum－Lactamases,ESBLs）是一類(lèi)水解底物譜相當廣泛的β－內酰胺酶。與以往常見(jiàn)的由質(zhì)粒介導的TEM－1，TEM－2和SHV－1β－內酰胺酶不同的是這些ESBLs不僅能水解青霉素和一、二代頭孢菌素，還能水解常用的三代頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢三嗪、頭孢噻肟及氨曲南等，但不能水解頭霉素類(lèi)如頭孢西丁和碳青霉烯類(lèi)如亞胺配能等。近年來(lái)已發(fā)現能水解頭孢西丁的ESBLs，對產(chǎn)生這類(lèi)酶的細菌目前尚缺乏簡(jiǎn)單而又特異性高的常規檢測法，從而給臨床治療帶來(lái)一定困難^[1,2]。

　　目前常規體外藥敏試驗很容易造成ESBLs的漏檢，像常見(jiàn)的攜帶ESBLs的肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌在常規體外藥敏試驗中常對頭孢他啶、頭孢三嗪、頭孢噻肟及氨曲南敏感而臨床使用這些藥物治療感染性疾病時(shí)則常導致失敗^[2～4]。只有使用ESBLs檢測方法才能檢測出細菌是否攜帶ESBLs，常用方法有雙紙片法，三維試驗，Etest等，需要設備的檢測方法像等電聚焦電泳法，分子生物學(xué)檢測法如限制性?xún)惹忻冈囼灐?SPAN lang=EN-US>PCR技術(shù)、基因序列分析等。

　　為了解腫瘤患者術(shù)后合并感染細菌中ESBLs流行的情況，我們采用上述方法中通用而又簡(jiǎn)便的雙紙片法篩選ESBLs陽(yáng)性的肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌，再用一種新型微量稀釋法進(jìn)行驗證，現將結果報告如下。

　　1　材料與方法

　　1.1　菌株均為我院1997年3月～1997年12月期間從腫瘤患者術(shù)后合并感染菌株中分離到的肺炎克雷伯氏菌27株和大腸埃希氏菌32株。

　　1.2　菌株鑒定采用API系統鑒定（Biomerieux,法國）。

　　1.3　雙紙片法初篩試驗^[2]

　　選用羥氨芐西林加克拉維酸藥敏紙片（BBL），頭孢他啶，頭孢噻肟，氨曲南藥敏紙片（自制），按K－B法操作，將羥氨芐西林加克拉維酸紙片貼在MH平皿中央，用兩種平皿，一種距其20mm處（以紙片中心為準）等距離貼頭孢他啶、頭孢噻肟及氨曲南藥敏紙片；另一種為距30mm處按上述方法貼紙片；經(jīng)35℃孵育18～24小時(shí)后觀(guān)察結果，如發(fā)現有協(xié)同作用，即初步認定ESBLs陽(yáng)性。質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯氏菌（WHO贈送），后者用來(lái)檢測克拉維酸是否失效。

　　1.4　ESBLs校正試驗微量稀釋法（金章醫用新技術(shù)研究所，天津），該方法采用微量48孔PVC平板進(jìn)行頭孢他啶、頭孢噻肟及氨曲南微量肉湯MIC測定（稀釋范圍均為0.25～30mg/L），以及上述三種藥物（稀釋范圍均為0.06～8mg/L）加克拉維酸組成（克拉維酸濃度為16mg/L）。具體操作方法為先將待測菌株用腦心浸液（Oxoid）增菌4～6小時(shí)，然后用麥氏比濁管0.5號進(jìn)行菌液濃度校正，校正完畢用無(wú)菌0.85％鹽水稀釋100倍后，使用一次性接種器將菌液移種到48孔PVC平板中，最終菌液接種濃度為(0.5～1)×105CFU/L。將試劑盒置于35℃溫箱孵育16～18小時(shí)觀(guān)察結果。分別讀出頭孢他啶（CAZ），頭孢噻肟（CTX）和氨曲南（AZT）的MIC以及上述三種藥物加克拉維酸（CL）的MIC值，分別用CAZ，CTX，AZT的MIC值除以CAZ＋CL，CTX＋CL及AZT＋CL的MIC值，凡結果≥8者為ESBLs陽(yáng)性。

　　2　結果

　　凡雙紙片法測ESBLs陽(yáng)性的菌株，經(jīng)用微量稀釋法證實(shí)均為ESBLs陽(yáng)性，具體情況分析如下。

　　27株肺炎克雷伯氏菌對CAZ、CTX和AZT的耐藥率分別為14.8％、3.7％和7.4％。ESBLs檢測陽(yáng)性率為14.8％(4/27)。其中同時(shí)耐三種抗生素的肺炎克雷伯氏菌有1株，其ESBLs檢測陽(yáng)性。耐CAZ和AZT的細菌有1株，但ESBLs檢測為陰性。單耐CAZ菌有3株，其中1株ESBLs檢測陽(yáng)性（圖1）。有2株肺炎克雷伯氏菌體外藥敏試驗顯示對CAZ、CTX和AZT均敏感，但ESBLs檢測陽(yáng)性。

圖1　圖中顯示待測肺炎克雷伯氏菌對CAZ耐藥，

　　mIC＞32mg/L對CAZ/CL則由于協(xié)同作用

　　mIC=4mg/L兩者比值＞8說(shuō)明ESBLs陽(yáng)性

　　32株大腸埃希氏菌對CAZ、CTX和AZT耐藥率分別為15.6％，6.3％和9.4％。ESBLs檢測率為9.4％(3/32)。其中同時(shí)耐三種抗生素的大腸埃希氏菌有2株，均未檢測出ESBLs。同時(shí)耐CAZ和AZT菌有1株且ESBLs檢測陽(yáng)性。單耐CAZ菌有1株，ESBLs檢測陽(yáng)性，還有1株ESBLs陽(yáng)性的大腸埃希氏菌體外藥敏試驗對CAZ、CTX和AZT均敏感。

　　在雙紙片初試中，發(fā)現用30mm間距有1株ESBLs陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌看不到協(xié)同作用，用20mm間距紙片檢測，顯示明顯的協(xié)同作用（圖2,3）。

圖2　從圖中可以看出ESBLs陽(yáng)性菌株由于距離較遠(30mm)

　　顯示陰性結果。平皿中央為羥氨芐西林/克拉維酸紙片。

　　周?chē)�分別為頭孢他啶(上)頭孢噻肟(右)氨曲南(左)

圖3與圖2比較，同一ESBLs陽(yáng)性菌株選用20mm距離顯示陽(yáng)性結果，紙片之間出現協(xié)同作用

　　3　討論

　　目前引起世界重視的細菌耐藥機制之一就是ESBLs。許多國家如歐洲的德國、法國、英國等，亞洲的日本、韓國、印度以及美國等地區均先后發(fā)現達幾十種之多的ESBLs，且多存在肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌中，在法國攜有ESBLs肺炎克雷伯氏菌的比例1985年為0.75％，1987年為8.4％，1988年就上升到11％^[1,5]。本組剛開(kāi)始此項工作就發(fā)現攜有ESBLs的肺炎克雷伯氏菌的比例已高達14.8％，隨著(zhù)抗生素的大量使用，這種升高趨勢仍將有所發(fā)展，值得臨床微生物工作者引起重視。

　　攜有ESBLs肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌給目前使用β－內酰胺酶類(lèi)抗生素治療帶來(lái)了一定困難。有資料表明當這些菌株常規藥敏試驗證實(shí)對CAZ耐藥而對CTX或AZT敏感時(shí)，隨著(zhù)接種菌量的增加CTX和AZT的MIC可以明顯增高。動(dòng)物試驗證實(shí)在這種情況下CTX或AZT的治療將導致失敗^[6,7]。本文結果也顯示出攜有ESBLs的肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌對CAZ、CTX和AZT大多呈敏感，只有采取專(zhuān)用ESBLs測定方法才能將其檢測出來(lái)。

　　從國外資料來(lái)看^[2,4,8,9]，臨床檢測ESBLs常用的方法有雙紙片法、三維試驗、Etest等。盡管方法不同，但其基本原理一致，就是利用廣譜β－內酰胺類(lèi)抗生素與β－內酰胺酶抑制劑如克拉維酸的協(xié)同作用有無(wú)來(lái)判斷細菌是否攜帶ESBLs。Jarlier等^[8]建議在雙紙片法中羥氨芐西林加克拉維酸紙片與頭孢三代類(lèi)抗生素紙片之間的距離以30mm為宜。也有的學(xué)者提出當以30mm間距為準的雙紙片法陰性時(shí)可改用20mm間距為準的雙紙片法重復一次^[4]�；�于上述觀(guān)點(diǎn)，我們采用兩種間距同時(shí)進(jìn)行，發(fā)現當ESBLs陽(yáng)性菌對頭孢三代類(lèi)抗生素高度耐藥無(wú)抑菌圈或很小時(shí)，用30mm間距的紙片就無(wú)法測出ESBLs，而用20mm間距就很易測出ESBLs。反之如果頭孢三代類(lèi)抗生素的抑菌圈較大，則20mm間距相對就會(huì )造成抑菌圈過(guò)度重疊而不易看出協(xié)同作用，這時(shí)使用30mm間距的雙紙片法就很易看出是否有協(xié)同作用，所以我們認為在檢測未知菌是否攜帶ESBLs時(shí)應該兩種間距同時(shí)進(jìn)行，既提高ESBLs檢出率又可縮短患者等待時(shí)間，有利于臨床醫生及時(shí)合理使用抗生素。

　　表1，2示Etest采用CAZ和CAZ＋CL在同一個(gè)試條上進(jìn)行檢測，該方法操作簡(jiǎn)便，可同時(shí)測出檢測菌的最低抑菌濃度（MIC）和ESBLs。缺點(diǎn)是該試紙條只有一種抗生素即CAZ，這樣對CAZ高度耐藥或MIC小于0.5的產(chǎn)ESBLs菌株，若用該方法可能檢測不出來(lái)。相比之下微量稀釋法不僅能同時(shí)檢測多種頭孢三代類(lèi)抗生素如CAZ、CTX和AZT和MIC，而且還能用上述三種頭孢菌素加克拉維酸同時(shí)檢測ESBLs，由于三種頭孢菌素對檢測菌的MIC值不盡相同，當一種抗生素由于MIC值過(guò)高或過(guò)低不能測出ESBLs時(shí)，另外兩種抗生素就可能剛好測出ESBLs，以資進(jìn)行互補，彌補了只用一種抗生素所造成的漏檢，可明顯提高ESBLs檢出率，本實(shí)驗也證實(shí)了這一點(diǎn)。

表1　微量稀釋法對4株肺炎克雷伯氏菌ESBLs陽(yáng)性檢測結果

　　CAZ:頭孢他啶CAZ＋CL:頭孢他啶＋克拉維酸CTX:頭孢噻肟CTX＋CL:頭孢噻肟＋克拉維酸

　　aZT:氨曲南AZT＋CL:氨曲南＋克拉維酸

表2微量稀釋法對3株大腸埃希氏菌ESBLs陽(yáng)性檢測結果

　　微量稀釋法操作非常簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，重復性好，終點(diǎn)很易判斷，但克拉維酸在冰凍液體條件中保存的有效時(shí)間較紙片短，因此，使用時(shí)應定期進(jìn)行檢測，以免失效，影響結果。

作者單位：天津醫科大學(xué)附屬腫瘤醫院細菌室（天津市300060）

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