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目的：探討吸水鏈霉菌FC904（S.hygroscopicus FC904）原生質(zhì)體形成的影響因素。方法：用溶菌酶處理S.hygroscopicus FC904的菌絲體，比較在不同條件下原生質(zhì)體的形成數。結果：S.hygroscopicus FC904在不同條件下原生質(zhì)體的形成數不同,其原生質(zhì)體形成的最適條件為：在菌絲體生長(cháng)培養基中添加0.7%甘氨酸及10%的蔗糖；采用生長(cháng)旺盛期的菌絲體制備原生質(zhì)體；溶菌酶適宜濃度為2mg/ml；溶菌溫度范圍30～37℃；溶菌前每毫升壓積菌絲體宜用P緩沖液5ml懸浮。結論：菌絲體生長(cháng)培養基成分、菌齡、溶菌酶濃度、溶菌溫度是影響S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的主要因素。
關(guān)鍵詞：吸水鏈霉菌FC904 原生質(zhì)體 制備
新型強效免疫抑制劑雷帕霉素以其強效低毒而備受世人注目。吸水鏈霉菌FC904（S.hygroscopicus FC904）是福建省微生物研究所分離的能產(chǎn)生雷帕霉素的菌株。本文摸索該產(chǎn)生菌原生質(zhì)體形成的最適條件，為進(jìn)一步進(jìn)行誘變育種、原生質(zhì)體融合以及遺傳學(xué)研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904
1.2 菌絲體培養基 由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O組成。
1.3 主要試劑 甘氨酸(上海新華化工廠(chǎng)),溶菌酶（上海伯奧生物科技公司）,原生質(zhì)體緩沖液（P緩沖液）按文獻［1］配制。
1.4 原生質(zhì)體制備
在菌絲體生長(cháng)培養基中添加10%蔗糖及0.7%甘氨酸，移種入孢子斜面培養物，于
2 結 果
在添加有甘氨酸及蔗糖的培養基中生長(cháng)的菌絲體有利于制備原生質(zhì)體，其濃度以甘氨酸0.7%及蔗糖10%最為適宜。不同菌齡的菌絲體對溶菌酶的敏感度不同，處于生長(cháng)旺盛期（菌齡42～46h）的菌絲體最有利于該菌株原生質(zhì)體的形成。適合于該菌株原生質(zhì)體形成的溶菌酶濃度為2mg/ml,繼續提高溶菌酶濃度，原生質(zhì)體形成數不再提高。有利于S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的適宜溫度范圍為30～37℃。溶菌前的菌絲體密度也會(huì )影響溶菌效果，離心后每毫升壓積菌絲體宜加P緩沖液5ml懸�。ū�1,2）。
表1 不同因素對S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的影響
|
影響因素 |
平均原生質(zhì)體數(個(gè)/ml) |
|
甘氨酸+蔗糖濃度(%) |
|
|
0.1+1 |
0 |
|
0.5+5 |
4.6×107 |
|
0.7+5 |
9.5×107 |
|
0.7+10 |
4.5×108 |
|
0.7+20 |
2.2×108 |
|
菌齡（h） |
|
|
24～30 |
0 |
|
42～46 |
3.8×108 |
|
50～54 |
3.0×105 |
|
溶菌酶濃度(mg/ml) |
|
|
0.5 |
0 |
|
1.0 |
6.5×105 |
|
2.0 |
4.1×108 |
|
4.0 |
4.6×108 |
|
溶菌溫度(℃) |
|
|
26 |
4.5×105 |
|
30 |
3.6×108 |
|
37 |
3.5×108 |
表2 菌絲體密度對S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體形成的影響
|
菌絲體壓積∶P緩沖液體積 |
平均原生質(zhì)體數(個(gè)/ml) |
|
1∶2 |
7.7×105 |
|
1∶5 |
4.3×108 |
|
1∶8 |
4.8×108 |
3 討 論
原生質(zhì)體無(wú)細胞壁，有利于生化或遺傳操作。原生質(zhì)體的分離依賴(lài)于菌絲細胞壁在裂解酶中的降解，同時(shí)受菌絲體培養基的成分、菌齡、溶菌酶濃度及酶解溫度等因素的影響。由于不同微生物的遺傳及生理特征各不相同，因此，原生質(zhì)體的分離制備因種而異，必須摸索適合于各自菌株的最佳原生質(zhì)體形成條件。
(1)在添加適當濃度的甘氨酸及蔗糖的培養基中生長(cháng)的菌絲體有利于制備原生質(zhì)體。細胞壁肽聚糖中的四肽側鏈由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸和D-丙氨酸組成［2］，甘氨酸可以替代肽聚糖中的D-丙氨酸，從而影響細胞壁之間的相互交聯(lián)，而蔗糖則可能會(huì )擾亂菌體生長(cháng)時(shí)的代謝過(guò)程［3］。因此，甘氨酸和蔗糖在抑制菌絲體生長(cháng)的同時(shí)也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性，在二者之間必須尋找一個(gè)適宜的濃度。對S.hygroscopicus FC904來(lái)說(shuō)，菌絲體生長(cháng)培養基中添加0.7%甘氨酸與10%蔗糖，最有利于S.hygroscopicus FC904原生質(zhì)體的形成。
�。�2）有報道太長(cháng)菌齡的菌絲壁易老化增厚，不利于原生質(zhì)體的釋放，太短菌體易破裂，原生質(zhì)體釋放量減少［4］。本文結果也表明菌齡適中，處于對數生長(cháng)期的菌絲體最有利于該菌株原生質(zhì)體的形成。
�。�3）實(shí)驗表明，溶菌酶濃度＞2mg/ml、溶菌溫度30～37℃都有利于制備原生質(zhì)體，但是最佳溶菌酶濃度及溶菌溫度應盡可能選擇較低者，因為溶菌酶濃度及溶菌溫度越高，原生質(zhì)體越不穩定且易破裂，造成再生困難［3］。
�。�4）溶菌前菌絲體密度太大也不利于溶菌，因為同等菌量的菌絲體在相同的溶菌酶濃度下，菌絲體密度越大，所用的溶菌酶量就越少。
作者單位：強華 (福建醫科大學(xué)微生物學(xué)教研室 福州 350004）
黃捷 (福建省微生物研究所 福州 350007）
參考文獻
1 鄧子新，唐紀良.鏈霉菌遺傳操作手冊.長(cháng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1988：173
2 陸德源(編).醫學(xué)微生物學(xué).第4版.北京：人民衛生出版社,1997：11
3 徐小雪,張庭蘭,鄭幼霞.影響鏈霉菌原生質(zhì)體形成、再生的因素.實(shí)驗生物學(xué)報,1984；17：25
4 韓 黎,陳世平,索繼紅.微小根毛霉致病株的原生質(zhì)體形成條件.微生物學(xué)通報,1998；25：27
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