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摘 要 為得到益生芽抱桿菌Bacillus subtilis MA139產(chǎn)芽抱的最佳的培養基，以搖瓶發(fā)酵的方法，用P1ackett-Burman設計從l1種原料中篩選出4種對芽抱產(chǎn)量有顯著(zhù)影響的因素，即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和MnSO4·H2O，然后針對這4個(gè)主要因素，用最陡爬坡試驗及中心組合設計優(yōu)化產(chǎn)芽抱的最佳培養基。結果證明，當培養基的配方為：玉米粉
關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；培養基優(yōu)化；試驗設計
抗生素添加劑在動(dòng)物日糧中廣泛使用，但其弊端和危害日益體現出來(lái)[1]，而抗生素替代品的微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)已得到應用[2]。微生態(tài)制劑常用的細菌是乳酸菌，而芽孢桿菌作為動(dòng)物腸道的外源菌群，也有廣泛應用，它能夠改善動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)平衡，促進(jìn)動(dòng)物生長(cháng)，提高飼料利用率[3-6]。優(yōu)良的微生態(tài)制劑必須有足夠的活菌數量[7]。因此，為了盡量提高產(chǎn)品芽孢的數量，需要對其產(chǎn)芽孢的培養基進(jìn)行系統優(yōu)化，以降低生產(chǎn)成本，提高芽孢得率[8]。
芽孢桿菌液體深層發(fā)酵培養基的優(yōu)化一般采用單因子試驗以及結合均勻設計和正交設計的方法[9-10]。目前趨向采用統計軟件構建高效試驗設計來(lái)進(jìn)行微生物培養基的優(yōu)化，通過(guò)對試驗結果進(jìn)行數學(xué)模擬和優(yōu)化，可以簡(jiǎn)化試驗步驟，提高準確性[11-14]。本試驗旨在以本試驗室分離篩選得到的一株枯草芽孢桿菌MA139為出發(fā)菌株，優(yōu)化產(chǎn)芽孢的最適培養基。
1、材料與方法
1.1、菌株
枯草芽孢桿菌MA139，本實(shí)驗室自行分離和保存。該菌株經(jīng)中科院微生物所鑒定，其16S rRNA基因序列在GenBank的登錄號為DQ415893。該菌株具有飼用益生菌的應用潛力。
1.2、培養基
1)種子及斜面保存培養基(SC培養基)
成分為葡萄糖
2)發(fā)酵培養基
分別按照Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗設計和中心組合設計的方法來(lái)配制。
1.3、試劑和原料
玉米、大豆為市售，粉碎后過(guò)2O目篩備用；試驗中其他試劑均為分析純。
1.4、培養條件
1)種子培養條件
250 mL三角瓶裝種子培養基5OmL，接斜面活化后的種子一環(huán)，
2)發(fā)酵培養條件
250mL三角瓶裝發(fā)酵培養基5OmL，按照4％的接種量接種后在
1.5、細菌總數和芽孢總數的測定
平板稀釋法計數活菌數。芽孢計數則將稀釋液放入8O℃水浴中處理20min后培養計數。
1.6、培養基優(yōu)化試驗設計
1)Plackett-Burman設計
在優(yōu)化初期利用Plackett-Burman設計法[15]，以葡萄糖(X1)、可溶性淀粉(X2)、玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、(NH4)2SO4(X5)、尿素(X6)、蛋白胨(X7)、MgSO4·7H2O(X8)、KH2PO4(X9)、CaC12(X10)、MnSO4·H2O(X11)等為試驗因子，對這11種原料進(jìn)行全面考察，并將其編碼為-1和+1的高低二階層，其所代表的質(zhì)量濃度值，見(jiàn)表1。
選用”n=12的Plackett-Burman設計，并加上3個(gè)中心點(diǎn)來(lái)篩選和探討11個(gè)試驗因子對細菌總數和芽孢總數的影響，每個(gè)試驗結果報告為2個(gè)重復試驗的平均值，見(jiàn)表2。
|
表1 Plackett-Burman試驗設計中各參數的編碼值及其質(zhì)量濃度 g/L | ||
|
獨立變量 |
編碼水平 | |
|
-1 |
+1 | |
|
葡萄糖(X1) |
5 |
15 |
|
可溶性淀粉(X2) |
5 |
15 |
|
玉米粉(X3) |
5 |
15 |
|
大豆粉(X4) |
10 |
30 |
|
(NH4)2S04(X5) |
2 |
6 |
|
尿素(X6) |
3 |
9 |
|
蛋白胨(X7) |
5 |
15 |
|
MgS04·7H2O(X8) |
0.5 |
1.5 |
|
KH2P04(X9) |
1 |
3 |
|
CaCl2(X10) |
2 |
6 |
|
MnS04·H2O(X11) |
0.05 |
0.5 |
2)最陡爬坡試驗設計
響應面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)結果，故只有在最先逼近最大目標產(chǎn)物產(chǎn)量區域后才能建立有效的響應面擬合方程[16]。以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長(cháng)，從而快速逼近產(chǎn)量最大值。根據Plackett-Burman設計的結果，來(lái)確定是否進(jìn)行最陡爬坡試驗。
3)中心組合設計
根據Plackett-Burman設計篩選出的試驗因子和最陡爬坡試驗確定的逼近濃度，以JMP5.0軟件設計中的DOE程序進(jìn)行中心組合試驗，擬合數據得到一個(gè)描述因變量(細菌總數)與自變量(培養基組分)關(guān)系的二階經(jīng)驗模型[11-17]：y=bo+ΣbiXi +ΣbijXiXj+ΣbiiX2ii；式中：y為預測響應值，即細菌總數(
2、結果與討論
2.1、影響芽孢桿菌增殖的重要因素
按照Plackett-Burman試驗設計，在發(fā)酵36h時(shí)取樣測定發(fā)酵液當中的細菌總數(total number，Ntot)和芽孢總數(spore number，Ns)。Plackett-Burman試驗設計結果見(jiàn)表2并對其進(jìn)行一階模式回歸分析(表3)。細菌總數和芽孢總數2種結果回歸分析的檢定系數分別為0.96和0.94，說(shuō)明回歸分析能夠確切地描述試驗數據。根據分析結果，發(fā)現對B.subtilis MA139發(fā)酵起主要作用有4種原料，即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和MnSO4·H2O，并對11種原料成分歸納調整，作為下一步試驗分析的依據。質(zhì)量濃度調整說(shuō)明見(jiàn)表4。
|
表2 Plackeet-Burman試驗設計結果(n=12) | |||||||||||||
|
編號 |
變量水平 |
響應值 | |||||||||||
|
X1 |
X2 |
X3 |
X4 |
X5 |
X6 |
X7 |
X8 |
X9 |
X10 |
X11 |
lg[Ntot/(cfu/ml)] |
lg[Ns/(cfu/ml)] | |
|
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
8.69 |
8.48 |
|
2 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.37 |
9.35 |
|
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.01 |
8.99 |
|
4 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
8.41 |
8.40 |
|
5 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
9.31 |
9.29 |
|
6 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
8.43 |
8.32 |
|
7 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
9.25 |
9.24 |
|
8 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.07 |
9.06 |
|
9 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
8.23 |
8.18 |
|
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.05 |
9.05 |
|
11 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
8.30 |
8.26 |
|
12 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
9.15 |
9.15 |
|
13 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
9.06 |
8.94 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.02 |
9.01 |
|
15 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
8.79 |
8.74 |
|
表3 Plackeet-Burman試驗設計回歸分析結果 cfu/L | ||||||
|
截距參數 |
細菌總數Ntot |
芽孢總數Ns | ||||
|
參數估計 |
t |
P |
參數估計 |
t |
P | |
|
intercept |
8.876 |
203.044 |
0.000 |
8.831 |
163.294 |
0.000 |
|
X1 |
-0.147 |
-3.001 |
0.058 |
-0.129 |
-2.136 |
0.122 |
|
X2 |
0.003 |
0.068 |
0.950 |
-0.009 |
-0.152 |
0.889 |
|
X3 |
-0.152 |
-3.103 |
0.053* |
-0.163 |
-2.688 |
0.075* |
|
X4 |
-0.190 |
-3.888 |
0.030** |
-0.221 |
-3.652 |
0.035** |
|
X5 |
-0.005 |
-0.102 |
0.925 |
-0.021 |
-0.345 |
0.753 |
|
X6 |
-0.082 |
-1.671 |
0.193 |
-0.099 |
-1.640 |
0.200 |
|
X7 |
-0.173 |
-3.547 |
0.038** |
-0.159 |
-2.633 |
0.078* |
|
X8 |
0.088 |
1.807 |
0.168 |
0.108 |
1.788 |
0.173 |
|
X9 |
0.097 |
1.978 |
0.142 |
0.106 |
1.750 |
0.178 |
|
X10 |
-0.005 |
-0.102 |
0.925 |
-0.034 |
-0.565 |
0.612 |
|
X11 |
0.157 |
3.205 |
0.049** |
0.158 |
2.605 |
0.080* |
|
P=0.082，RSq=0.96 P=0.125，RSq=0.94 | ||||||
注：*為P＜0.1，**＜0.05。
|
表4 Plackeet-Burman試驗設計各因子結果的質(zhì)量濃度分析 | |||
|
試驗因子 |
質(zhì)量濃度（g/L） |
說(shuō)明 | |
|
調整前 |
調整后 | ||
|
葡萄糖(X1) |
5-15 |
5 |
對細菌總數和芽孢總數為負相關(guān)，對細菌總數影響達到顯著(zhù)水平，而對芽孢總數的影響不顯著(zhù)，為了減少試驗因子，維持在低水平 |
|
可溶性淀粉(X2) |
5-15 |
刪除 |
無(wú)顯著(zhù)影響，可信度大于20%，刪除此因子 |
|
玉米粉(X3) |
5-15 |
1-5 |
負顯著(zhù)，降低篩選濃度 |
|
大豆粉(X4) |
10-30 |
1-10 |
負極顯著(zhù)，降低篩選濃度 |
|
(NH4)2S04(X5) |
2-6 |
刪除 |
無(wú)顯著(zhù)影響，可信度大于20%，刪除此因子 |
|
尿素(X6) |
3-9 |
3 |
不顯著(zhù)，負相關(guān)，可信度小于20%，為減少試驗因子，維持在低水平 |
|
蛋白胨(X7) |
5-15 |
1-5 |
負顯著(zhù)，降低篩選濃度 |
|
MgS04·7H2O(X8) |
0.5-1.5 |
1.5 |
不顯著(zhù)，可信度小于20%，為減少試驗因子，維持在高水平 |
|
KH2P04(X9) |
1-3 |
3 |
不顯著(zhù)，正相關(guān)，P值相對較小，維持在高水平 |
|
CaCl2(X10) |
2-6 |
刪除 |
不顯著(zhù)，可信度大于20%，刪除此因子 |
|
MnS04·H2O(X11) |
0.05-0.5 |
0.5-1.5 |
顯著(zhù)，正相關(guān)，提高篩選濃度 |
2.2、最陡爬坡試驗
選取對 B.subtilis MA139發(fā)酵 4種主要原料。對Plackett-Burman試驗設計中得到的結果進(jìn)行t檢驗，比較中心點(diǎn)水平的平均響應值與試驗點(diǎn)處的平均響應值間的差異顯著(zhù)性。試驗結果顯示，中心點(diǎn)水平與試驗點(diǎn)間在a=0．05水平上不顯著(zhù)(P值分別是0.460和0.388)，這就表明本試驗設計中選取的中心點(diǎn)水平還沒(méi)有接近最大的響應區域內，因此還必須進(jìn)一步尋找中心點(diǎn)值，也就是最陡爬坡試驗。
以回歸系數最大的大豆粉(X4)為基準，以每次減少濃度1%為基本步長(cháng)(△)。處理5中的細菌總數和芽孢總數達到了最高，這一結果表明，處理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白胨(X7)、MnSO4·H20(X11)這4種物質(zhì)濃度已在最優(yōu)點(diǎn)附近，可以此濃度為中心點(diǎn)采用中心組合設計來(lái)對培養基作進(jìn)一步的優(yōu)化(表5)。而且在Plackett-Burman設計及最陡爬坡試驗中，細菌總數與芽孢總數的分析結果一致，故在以下的中心組合設計僅以發(fā)酵液的細菌總數作為考察目標。
|
表5 最陡爬坡試驗設計及其結果 | ||||||
|
處理序號 |
培養基成分/（g/L） |
結果 | ||||
|
玉米粉（X3） |
大豆粉（X4） |
蛋白胨（X7） |
MnSO4·H20（X11） |
lg[Ntot/(cfu/ml)] |
lg[Ns/(cfu/ml)] | |
|
1 |
5.00 |
10.00 |
5.00 |
0.50 |
9.33 |
9.28 |
|
2 |
4.52 |
9.00 |
4.52 |
0.61 |
9.37 |
9.30 |
|
3 |
4.08 |
8.00 |
4.08 |
0.72 |
9.13 |
9.12 |
|
4 |
3.64 |
7.00 |
3.64 |
0.83 |
9.34 |
9.29 |
|
5 |
3.20 |
6.00 |
3.20 |
0.94 |
9.43 |
9.40 |
|
6 |
2.76 |
5.00 |
2.76 |
1.05 |
9.39 |
9.34 |
|
7 |
2.32 |
4.00 |
2.32 |
1.16 |
9.10 |
9.01 |
|
8 |
1.88 |
3.00 |
1.88 |
1.27 |
9.17 |
9.15 |
|
9 |
1.44 |
2.00 |
1.44 |
1.38 |
9.06 |
8.95 |
|
10 |
1.00 |
1.00 |
1.00 |
1.50 |
8.91 |
8.84 |
2.3、中心組合設計
以最陡爬坡試驗中處理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白胨(X7)、MnSO4·H2O(X11)的濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，選擇中心試驗點(diǎn)為3，星號臂長(cháng)γ=1.547。各自變量水平見(jiàn)表6，試驗設計及結果見(jiàn)表7。
分析結果表明(表8)，模型極顯著(zhù)(P＜0.01)，并且有很好的確定系數，RSq=0.93。這表明B.subtilis MA139細菌總數93%的可靠性可由模型來(lái)預測。并可以通過(guò)回歸分析結果得出試驗模型：
y=9.434-0.003X3-0.025X4+0.028X7-0.013X11-0.006X3X4-0.02X3X7-0.009X4X7-0.012X3X11-0.026X4X11-0.03X7Xll-0.068X3X3-0.013X4X4-0.043X7X7-0.025X11X11
自變量前的數值為回歸模型對應項的 P值。
根據JMP模型的分析結果以及二次回歸方程可以得出，此模型具有最大響應值，極值分析結果見(jiàn)表9。根據結果換算成4個(gè)主因素的實(shí)際濃度值，即玉米粉
為了檢驗模型預測的準確性，采用優(yōu)化的培養基重復試驗3次，發(fā)酵液當中平均細菌數為 2.91×l09cfu/mL，這表明實(shí)驗值和實(shí)際值之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。
|
表6 中心組合設計各因子及其編碼值 g/L | |||||
|
獨立變量 |
編碼水平 | ||||
|
-1.547 |
-1 |
0 |
1 |
1.547 | |
|
玉米粉（X3） |
1.65 |
2.20 |
3.20 |
4.20 |
4.75 |
|
大豆粉（X4） |
4.45 |
5.00 |
6.00 |
7.00 |
7.55 |
|
蛋白胨（X7） |
1.65 |
2.20 |
3.20 |
4.20 |
4.75 |
|
MnSO4·H20（X11） |
0.55 |
0.69 |
0.94 |
1.19 |
1.32 |
|
表7 中心組合設計及其結果 | ||||||||||||
|
編號 |
變量水平 |
lg[Ns/(cfu/ml)] |
|
編號 |
變量水平 |
lg[Ns/(cfu/ml)] | ||||||
|
X3 |
X4 |
X7 |
X11 |
X3 |
X4 |
X7 |
X11 | |||||
|
1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
9.36 |
15 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
9.39 | |
|
2 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
9.36 |
16 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
9.27 | |
|
3 |
1.547 |
0 |
0 |
0 |
9.28 |
17 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
9.24 | |
|
4 |
-1.547 |
0 |
0 |
0 |
9.27 |
18 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
9.31 | |
|
5 |
0 |
0 |
0 |
1.547 |
9.34 |
19 |
0 |
0 |
-1.547 |
0 |
9.30 | |
|
6 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
9.23 |
20 |
0 |
-1.547 |
0 |
0 |
9.46 | |
|
7 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
9.30 |
21 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.29 | |
|
8 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
9.20 |
22 |
0 |
0 |
1.547 |
0 |
9.37 | |
|
9 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.42 |
23 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.44 | |
|
10 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9.43 |
24 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
9.20 | |
|
11 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
9.29 |
25 |
0 |
1.547 |
0 |
0 |
9.34 | |
|
12 |
1 |
1 |
1 |
1 |
9.20 |
26 |
0 |
0 |
0 |
-1.547 |
9.41 | |
|
13 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
9.34 |
27 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
9.36 | |
|
14 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
9.20 |
|
|
|
|
|
| |
|
表8 中心組合設計(CCD)回歸分析結果 | ||||||||||
|
回歸系數 |
參數估計 |
標準差 |
t |
P |
|
回歸系數 |
參數估計 |
標準差 |
t |
P |
|
Intercept |
9.434 |
0.015 |
638.810 |
0.000 |
Intercept |
9.434 |
0.015 |
638.810 |
0.000 | |
|
X3 |
-0.003 |
0.007 |
-0.391 |
0.702 |
X3X11 |
-0.012 |
0.007 |
-1.635 |
0.128 | |
|
X4 |
-0.025 |
0.007 |
-3.860 |
0.002 |
X4X11 |
-0.026 |
0.007 |
-3.491 |
0.004 | |
|
X7 |
0.028 |
0.007 |
4.282 |
0.001 |
X7X11 |
-0.030 |
0.007 |
-4.067 |
0.002 | |
|
X11 |
-0.013 |
0.007 |
-1.961 |
0.074 |
X3X3 |
-0.068 |
0.009 |
-7.672 |
0.000 | |
|
X3X4 |
-0.006 |
0.007 |
-0.855 |
0.409 |
X4X4 |
-0.013 |
0.009 |
-1.522 |
0.154 | |
|
X3X7 |
-0.020 |
0.007 |
-2.615 |
0.023 |
X7X7 |
-0.043 |
0.009 |
-4.891 |
0.000 | |
|
X4X7 |
-0.009 |
0.007 |
-1.257 |
0.233 |
X11X11 |
-0.025 |
0.009 |
-2.805 |
0.016 | |
|
表9 響應面極值分析 | ||||||
|
臨界值 |
估計值 |
細菌總數Nt/(cfu/ml) |
穩定點(diǎn)模型 | |||
|
X3 |
X4 |
X7 |
X11 | |||
|
-0.03 |
-1.2 |
0.42 |
0.12 |
9.454 |
2.84×109 |
最大值 |
2.4、優(yōu)化結果驗證
采用優(yōu)化后的培養基與起始的種子培養基進(jìn)行對照，并對培養條件進(jìn)行優(yōu)化，結果表明，優(yōu)化后的培養基提高了各階段細菌總數的數量，在36h時(shí)，優(yōu)化后培養基可以使細菌總數從 8.32×108cfu/mL提高到3.10×109cfu/mL，并且在36h時(shí)，芽孢率可以達到96%。
3、結論
通過(guò) Plackett Burman設計、最陡爬坡試驗及中心組合設計的方法確定了B.subtilis MA139發(fā)酵培養的最適培養基。優(yōu)化后B.subtilis MA139的細菌濃度為3.10×109cfu/mL，芽孢率達到96%從而有效的提高了單位產(chǎn)芽孢的數量
作者：郭小華 陸文清 鄧萍 黃德仕
作者單位：中國農業(yè)大學(xué)農業(yè)部飼料工業(yè)中心 中國農業(yè)大學(xué)農業(yè)部飼料工業(yè)中心 中國農業(yè)大學(xué)農業(yè)部飼料工業(yè)中心 中國農業(yè)大學(xué)農業(yè)部飼料工業(yè)中心
