應用和評價(jià)一種檢測甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的顯色培養基

甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）已經(jīng)成為世界范圍內醫院感染的重要致病菌，而且其引起的社區感染也日益增多，盡管還存在較多爭議，基于實(shí)驗室的方法篩選病人和保健工作者定植的MRSA仍然是限制其擴散、控制其感染的基礎。

臨床實(shí)驗室中已經(jīng)建立了多種方法來(lái)檢測MRSA，其中最多見(jiàn)的是在培養基中添加了苯唑西林或甲氧西林的培養方法，這種方法可以區分MRSA和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA），目前最常用的培養基是添加了苯唑西林的高鹽甘露醇瓊脂，但一些研究顯示其靈敏性和特異性均具有一定的局限性。改良的苯唑西林耐藥高鹽甘露醇培養基（ORSAB）因含有氯化鋰和多粘菌素并以苯胺藍作為pH指示劑，所以其選擇性更強，但一些使用ORSAB的獨立研究發(fā)現其在靈敏度和特異性方面仍存在相似的局限性。

對環(huán)丙沙星耐藥被認為是檢測MRSA的替代標記，而且這種藥物也被成功的添加入Baird-Parker 培養基和甘露醇肉湯中，但這種方法也有其局限，因為他不能檢測出在一些地區存在的對環(huán)丙沙星敏感的MRSA菌株。我們的室內實(shí)驗室方法是使用一種含多粘菌素E、氨曲南、環(huán)丙沙星和氯化鈉的選擇性甘露醇肉湯（SMB），MRSA菌株由于發(fā)酵甘露醇或/和海藻糖而酸化酚紅從而使其在培養基中肉眼可見(jiàn)，這種方法以前被報道在分離MRSA方面要優(yōu)于含有環(huán)丙沙星的Baird-Parker 培養基和添加了4mg/L苯唑西林的高鹽甘露醇培養基。

培養基中添加顯色的酶底物已被用來(lái)分離金黃色葡萄球菌，同傳統的方法相比這種方法具有高度的敏感性和特異性。兩項研究報道了使用含有甲氧西林或苯唑西林的金黃色葡萄球菌顯色瓊脂來(lái)分離特定的MRSA菌株：Merlino等在培養基中添加了八種藥物發(fā)現多重耐藥的MRSA可以有效的生長(cháng)但社區獲得性MRSA生長(cháng)卻不充分；Kluytmans等使用了含有4mg/L苯唑西林的金黃色葡萄球菌顯色瓊脂發(fā)現經(jīng)24小時(shí)的培養后它對檢測MRSA具有很高的特異性但敏感性較低。上述兩項對培養基的評估研究均未使用臨床的病理標本。最近另外一種培養基，S. aureus ID ，被用來(lái)分離鑒定金黃色葡萄球菌并顯示出較高的敏感性和特異性。這種培養基對非葡萄球菌（包括腸球菌）具有高度選擇性，而金黃色葡萄球菌在培養基上由于產(chǎn)生α葡萄糖苷酶可形成綠色菌落。本研究的主要目的是采用S. aureus ID建立一種可用來(lái)特異性分離臨床標本中MRSA的培養基，次要目的是將此培養基和我們的室內實(shí)驗室方法及其他商業(yè)購買(mǎi)的選擇培養基進(jìn)行比較。

材料和方法 培養基 S.auraus ID的成分由法國bioMe´rieux公司提供，按照廠(chǎng)家的說(shuō)明制備培養基然后冷卻到50℃。頭孢西丁、甲氧西林和苯唑西林購自英國Sigma化學(xué)公司，環(huán)丙沙星得自英國Bayer診斷公司。每種藥物根據其效價(jià)稱(chēng)重并用無(wú)菌蒸餾水倍比稀釋?zhuān)�濃度范圍�?SPAN lang=EN-US>320至1.2mg/L），每份稀釋液取1ml和19 ml S.auraus ID培養基混合后倒入培養皿，配制好的瓊脂平板中每種抗菌藥物的終濃度16至0.06 mg/L，含有甲氧西林或苯唑西林的瓊脂平皿還需添加入終濃度為2％的氯化鈉。同時(shí)制備不含有抗菌藥物的瓊脂平皿作為對照（含有或不含有2％氯化鈉）。 ORSAB（CM1008）得自英國Oxide公司，按照廠(chǎng)家說(shuō)明加入抗生素（SRO195）。CHROMagar Staph aureus干粉（TA677）得自英國M-Tech 診斷公司，加入廠(chǎng)家提供得指定批次的抗生素（X018）制備成CHROMagar MRSA，每個(gè)培養皿的瓊脂含量為20ml。SMB的制備按照以前的文獻報道。

菌株 36株分離自歐洲各地代表最常見(jiàn)類(lèi)型的MRSA菌株由英國倫敦colindale健康保護機構提供并凍干保存，這些國家包括比利時(shí)、芬蘭、法國、德國和英國。MRSA菌株NCTC11939作為標準對照。收集的21株MSSA菌株中包括18株連續分離自我們實(shí)驗室血培養陽(yáng)性的野生株和另外3株標準對照菌株：NCTC4163、 NCTC8530及 NCTC6571。 將上述每個(gè)菌株重新接種到單個(gè)哥倫比亞瓊脂（Oxide）平板上，在需氧條件下37℃過(guò)夜孵育培養，挑取生長(cháng)出的每個(gè)菌株的菌落在無(wú)菌去離子水中制成懸液并用Densimat(bioMe´rieux)將菌液濁度校正到1.0麥氏單位，然后用無(wú)菌去離子水將每個(gè)懸液1：30稀釋使其菌液濃度大約為107CFU/ ml 。使用多點(diǎn)接種器（Mast Laboratories Bootle 英國）接種1μl已稀釋好的每種菌液到S.auraus ID平板上（內含上述各種濃度的抗菌藥物）。將菌液進(jìn)一步按1：100稀釋?zhuān)�然后以上述相同的方式接種，總之，每種待測菌的最終接種量大約為每接種點(diǎn)10000CFU和100CFU，同時(shí)所有菌株（包括兩種接種濃度）也被接種到CHROMagar MRSA 和ORSAB上。所有培養基在需氧條件下37℃孵育培養48h，在24h和48h后檢查培養基并以菌落在培養基上是否生長(cháng)和顯色報告為陽(yáng)性或陰性。重復操作上述所有試驗一次以檢驗其和重復性。制備大批的含有4 mg/L 頭孢西丁的S.auraus ID并于4℃儲存8周，同時(shí)按上述方法制備和儲存CHROMagar MRSA 和ORSAB。分別在第一天及2、4、6、8周后在每種培養基上接種10個(gè)MSSA和10個(gè)MRSA菌株，接種量為前述的每接種點(diǎn)10000CFU。在24h和48h后檢查培養基并以菌落在培養基上是否生長(cháng)和顯色報告為陽(yáng)性或陰性。重復操作上述所有試驗一次以檢驗其重復性。

臨床標本 本次研究中共在我們實(shí)驗室中收集了747個(gè)拭子來(lái)篩選MRSA，這些拭子來(lái)自205個(gè)不同病人如下部位：鼻腔（192）、咽喉（180）、腋部（209）、會(huì )陰（119）和傷口（47）。將每個(gè)拭子浸入750μl無(wú)菌生理鹽水（0.85％）攪拌混勻，然后取50μl懸液接種到ORSAB、CHROMagar MRSA和添加了4mg/L苯唑西林S.auraus ID上（MRSA ID），同時(shí)取50μl懸液接種于2mlSMB，上述操作確保了每種培養基都接受了相同的標本接種量。所有培養基均在空氣中37℃孵育22h至24h后，任何標本在SMB中出現顏色變化（如呈現桔黃或黃色）則取50μl在哥倫比亞血瓊脂上傳代培養，繼續在空氣中37℃孵育22h至24h。所有培養皿在培養22至24h時(shí)和48h后由兩個(gè)實(shí)驗室工作人員判讀結果，每種培養基的判讀都互相獨立不了解其他培養基上的結果。

MRSA的鑒定 MRSA菌株在CHROMagar MRSA 上為紫紅色菌落，在MRSA ID 上為綠色菌落，在ORSAB為藍色菌落，若試驗中出現上述顏色變化則為陽(yáng)性結果并將菌落轉種于哥倫比亞血瓊脂,無(wú)顏色變化的菌落則不做進(jìn)一步研究。MRSA的確證通過(guò)聯(lián)合試驗，包括Slidex Staph Plus 膠乳凝集試驗(bioMe´rieux)、試管凝集試驗和檢測青霉素結合蛋白2a（PBP2a）的Mastalex 膠乳凝集試驗（Mast Laboratories）。哥倫比亞血瓊脂上（轉種自SMB肉湯）任何像葡萄球菌的菌落也通過(guò)上述方法鑒定。表1 質(zhì)控MRSA菌株在ORSAB、CHROMagar MRSA及添加不同抗菌藥物的S.auraus ID上生長(cháng)和產(chǎn)色的菌株數

 a大接種量指10000CFU/點(diǎn) b小接種量指100CFU/點(diǎn) c不含抗菌藥物的培養基有無(wú)2％氯化鈉其結果相同 結果

選擇分離MRSA最好的藥物 表1顯示了添加入S.auraus ID中最佳抗菌藥物濃度，這些藥物濃度是防止MSSA菌株在孵育48h后生長(cháng)所需的最小濃度，所有MRSA菌株在未添加抗菌藥物的S.auraus ID上生長(cháng)良好并產(chǎn)生特征性綠色，盡管有兩株菌需48h才出現顏色變化。對于大接種量（約10000CFU/點(diǎn)）的MRSA菌株，除了3株菌（對環(huán)丙沙星敏感，MIC為0.25 mg/L）外，其他菌株抗菌藥物對其生長(cháng)和顏色變化無(wú)影響；對小接種量（約100CFU/點(diǎn)）某些抗菌藥物對MRSA菌株的生長(cháng)具有較大影響，特別是在表現其α葡萄糖苷酶活性方面（表1）。例如甲氧西林、環(huán)丙沙星和苯唑西林可分別使26％、26％和34％的MRSA菌株在孵育24h后不形成綠色菌落，而頭孢西丁是唯一使所有MRSA菌株均生長(cháng)而只有1株（3％）MRSA的顏色變化受影響的抗菌藥物，基于這些結果，MRSA ID被確定為在S.auraus ID中添加4 mg/L 頭孢西丁。

在CHROMagar MRSA上，當大接種量時(shí)，所有37株MRSA菌株都能生長(cháng)且在孵育24h后都形成紫紅色菌落（表1）；當小量接種時(shí)，35株菌（94.6％）能夠生長(cháng)并在孵育24h后形成紫紅色菌落。ORSAB的效果較CHROMagar MRSA差，當大接種量時(shí)，只有35株MRSA菌株（94.6％）能生長(cháng)并在孵育24h后形成綠色菌落；當小量接種時(shí)，只有30株菌（81％）能夠生長(cháng)并在孵育24h后形成綠色菌落。三種培養基在4℃儲存8周后各項試驗結果均一致，如MSSA菌株都被有效抑制，MRSA菌株的生長(cháng)和顏色形成也未受影響。當試驗重復進(jìn)行時(shí)所有的結果發(fā)現也均一致。

MRSA ID檢測臨床標本的評價(jià) 來(lái)自43個(gè)病人的85份拭子在一個(gè)或多個(gè)培養基上經(jīng)48h孵育后證實(shí)有MRSA菌株生長(cháng)。所有菌株經(jīng)Slidex Staph Plus 膠乳凝集試驗、試管凝集試驗和PBP2膠乳凝集試驗均陽(yáng)性，所有受測試培養基都未分離出MSSA菌株。表2顯示了每種培養基分離的MRSA菌株數。在MRSA ID上經(jīng)22-24h孵育培養后共有68（80％）株分離菌株出現明顯綠色菌落，另有8株在孵育48小時(shí)后才被檢測到，未能檢測出的9株菌在MRSA ID上均有少量分離菌落生長(cháng)，在其他任何瓊脂培養基上產(chǎn)生的菌落數也不超過(guò)兩個(gè)，其中有3株菌只有SMB可以分離出。在孵育22-24h后MRSA ID方法要優(yōu)于分別檢測出50個(gè)（59％）和53個(gè)（62％）分離株的CHROMagar MRSA和ORSAB方法。

在培養22至24h后，MRSA ID的特異性（99.5％）也要高于本研究使用的其他方法（表2），所有瓊脂培養基方法的特異性在培養48h后會(huì )降低，MRSA ID最顯著(zhù)。在試驗中瓊脂上產(chǎn)生的任何綠色菌落都應視為陽(yáng)性結果，大量的凝固酶陰性葡萄球菌只有在培養48h后可產(chǎn)生淡綠色菌落而MRSA菌株在培養48h后產(chǎn)生深綠色菌落，在實(shí)踐中很容易相鑒別。

表3顯示了MRSA菌株的不同分離部位以及不同培養基對不同類(lèi)型標本的敏感率，如對來(lái)自鼻腔拭子的MRSA，培養48h后CHROMagar MRSA、MRSA ID 和ORSAB的敏感率無(wú)差別，而對來(lái)自會(huì )陰拭子的MRSA，MRSA ID的敏感率要高于其他所有培養基，可能是受標本中其他菌種競爭性的影響。表4顯示出某些MRSA菌株只能被一種方法檢測出及一些病人只能被一種方法檢測到MRSA陽(yáng)性，如85株MRSA菌株中，7株只被MRSA ID在培養22至24h后檢測出，而有3個(gè)病人只有使用MRSA ID方法培養22至24h后才檢測到MRSA菌株，另外有1個(gè)病人只有ORSAB法、兩個(gè)病人只有SMB方法檢測出 MRSA陽(yáng)性。在43個(gè)MRSA陽(yáng)性的病人中12人在CHROMagar MRSA上和SMA中培養22至24h后未能檢測出。

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