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【摘要】 目的 了解臨床分離大腸埃希菌耐環(huán)丙沙星gyrA基因突變情況。方法 用環(huán)丙沙星濃度梯度法試條檢測臨床分離大腸埃希菌最低抑菌濃度（MIC），聚合酶鏈反應(PCR)擴增gyrA基因喹諾酮耐藥決定區，擴增產(chǎn)物片段長(cháng)度為668 bp，用限制性?xún)惹忻窰infⅠ消化PCR產(chǎn)物，行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果 共檢測大腸埃希菌41株，14株MIC在0.25～0.5 μg／ml的菌株，未檢出耐藥性突變位點(diǎn)；4株MIC在1～2 μg／ml的菌株（2株MIC為1μg／ml、1株為1.5 μg／ml，1株為2 μg／ml）均出現gyrA基因突變；耐藥菌23株（1株MIC為16 μg／ml，其余≥32 μg／ml）也均發(fā)生gyrA基因突變。結論 臨床分離大腸埃希菌對環(huán)丙沙星耐藥性與HinfⅠ酶切位點(diǎn)突變密切相關(guān)，低水平耐藥菌株gyrA基因發(fā)生突變具有一定臨床意義。
A gyrA gene mutation in clinical Escherichia coli Zhang Junmin, Wu Jian, Zhao Liping, et al. Department of Microbiology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study a gyrA mutation of clinical E.coli strains.Methods We used Ciprofloxacin Etest to detect the MIC values of clinical E.coli strains, then PCR to amplify the quinolone-determining region (QRDR) of the gyrA gene, and digest the PCR products (668 bp) with HinfⅠ and 8% polyacrylamide gel electrophoresis.Results Fourty-one strains of E.coli were detected. Fourteen strains with MIC 0.25～0.5 μg/ml exhibited no gyrA mutation, but 4 strains with MIC 1～2 μg/ml and 23 strains with MIC 16～23 μg/ml gyrA gene mutation.Conclusion There was a close relationship between the clinical quinolone-resistant E.coli strains and the loss of HinfⅠ sits in gyrA gene. The gyrA gene mutation found in low-level Ciprofloxacin resistant E. coli will be useful to manage these resistant strains.
【Key words】 E.coli Ciprofloxacin gyrA gene Mutation
近年來(lái)臨床分離大腸埃希菌對喹諾酮類(lèi)耐藥性的顯著(zhù)上升趨勢，引起了臨床和微生物實(shí)驗室的廣泛關(guān)注。編碼DNA旋轉酶的gyrA或gyrB基因發(fā)生點(diǎn)突變被認為是產(chǎn)生耐藥性的主要原因［1］。用聚合酶鏈反應(PCR)－限制性?xún)惹忻钙伍L(cháng)度多態(tài)性(RFLP)檢測大腸埃希菌gyrA基因突變位點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)便、易行的方法［2］。為此，我們利用此方法對臨床分離大腸埃希菌gyrA基因突變情況進(jìn)行了研究，現將結果報告如下。
材料與方法
一、材料
1.菌株：臨床分離大腸埃希菌41株：23株為耐藥菌，其中1株環(huán)丙沙星最低抑菌濃度(MIC)為16 μg／ml，其余22株MIC≥32 μg／ml；2株MIC分別為1.5 μg/ml和2 μg／ml；敏感菌16株，其中14株MIC在0.25～0.5 μg／ml，2株MIC為1μg／ml。同時(shí)也檢測大腸埃希菌ATCC 25922。
2.環(huán)丙沙星濃度梯度法試條、藥敏用培養基均為AB Biodisk產(chǎn)品。試條MIC結果按美國臨床試驗室標準化委員會(huì )1996年標準判斷。環(huán)丙沙星MIC≤1μg／ml為敏感，MIC≥4μg／ml為耐藥。
二、方法
1.DNA提�。喊次墨I［3］進(jìn)行，不做RNA消化，DNA溶于0.5ml TE緩沖液中待用。
2.PCR反應擴增：喹諾酮耐藥決定區(QRDR)引物按文獻［2］，引物1為5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′，引物2為5′-CCGGTACGGTAAG-CTTCTTCAA-3′，由中國科學(xué)院微生物研究所基因工程中心合成。PCR體積25 μl：Tris-HCl 10 mmol/L，pH9.0、KCl 50 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、Triton X-100 0.1％、4×dNTPs各200 μmol/L北京寶秦克生物科技公司產(chǎn)品；引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1UPromega公司產(chǎn)品。DNA模板5 μl。93℃預變性5分鐘，93℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。最后72℃再延伸6分鐘。1.5％瓊脂糖凝膠電泳。
3.HinfⅠ酶切分析：方法按文獻［4］進(jìn)行，反應總體積20 μl：2 μl 10×反應緩沖液、10 μl PCR擴增產(chǎn)物、6 μl無(wú)菌水、2 μl HinfⅠ限制性?xún)惹忻福?U／μl，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司產(chǎn)品），8 000 r／min離心30秒，放37℃作用4小時(shí)，取10 μl消化產(chǎn)物行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，150V電壓1.5小時(shí)。放含0.5 μg／ml溴化乙啶的1×TBE緩沖液染色30分鐘，觀(guān)察結果并照相。
結果
用PCR方法對41株大腸埃希菌及大腸埃希菌ATCC 25922QRDR進(jìn)行擴增，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)，均擴增出一條片段長(cháng)度為668 bp的產(chǎn)物。
對上述擴增產(chǎn)物用限制性?xún)惹忻窰infⅠ消化后行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果見(jiàn)附圖。電泳結果顯示環(huán)丙沙星MIC在0.25～0.5 μg／ml的大腸埃希菌及標準菌株，酶切后均為3條DNA帶，表明這些菌株的HinfⅠ酶切位點(diǎn)未發(fā)生突變；而2株MIC為1 μg／ml的菌株、2株中介度的菌株以及所有耐藥菌株，HinfⅠ酶切后則為2條DNA帶，表明該酶切位
1：pBR322DAN/HinfⅠ；2：大腸埃希菌ATCC 25922；MIC依次：3號0.25，4號0.5，5號1，6號1.5，7號2，8號16，9、10、11號≥32 μg/ml
附圖 大腸埃希菌QRDR擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳點(diǎn)發(fā)生突變。
討論
喹諾酮類(lèi)抗菌藥物如環(huán)丙沙星等因其抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在臨床得到廣泛應用。但隨著(zhù)這類(lèi)藥物的應用，耐藥菌也在不斷增加，其中以大腸埃希菌耐藥性增加最為顯著(zhù)［3］。我們分離的大腸埃希菌對環(huán)丙沙星耐藥率從1994年的41.9％上升至1997年的60.4％。而其他腸桿菌科常見(jiàn)細菌如陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌等1997年耐藥率還不到12％。而從泌尿系感染病人分離的菌株，耐藥率又較非泌尿系感染病人高。從1994年的55.1％上升至1997年的73.8％。造成這一現象的原因主要與近年來(lái)喹諾酮類(lèi)藥物的大量使用及不合理應用，引起抗生素介導的選擇性耐藥突變有關(guān)［5］。
大腸埃希菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性是由染色體介導的，這包括與DNA旋轉酶（DNA gyrase）合成有關(guān)的結構基因如gyrA和gyrB，以及與細胞膜通透性或藥物排泄能力有關(guān)的調控基因發(fā)生突變，均可導致大腸埃希菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生不同程度的耐藥性［1］。Yoshida等［6］報道gyrA基因單位點(diǎn)突變可導致大腸埃希菌對喹諾酮類(lèi)耐藥，突變發(fā)生在gyrA N末端氨基酸67～106范圍內，稱(chēng)為QRDR。Fisher等［7］證實(shí)gyrA基因中密碼子83(有時(shí)可能是82)發(fā)生突變常常造成大腸埃希菌對喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥，該位點(diǎn)的突變可用限制性?xún)惹忻窰infⅠ酶切證實(shí)。這一方法簡(jiǎn)便易行，在研究其他細菌耐喹諾酮類(lèi)gyrA基因突變中也有應用［8］。我們也是利用這一原理對大腸埃希菌gyrA基因進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測。
大腸埃希菌gyrA基因發(fā)生單位點(diǎn)突變時(shí)，僅對環(huán)丙沙星低水平耐藥，而這部分菌株一般用常規檢測MIC方法難以檢出，在抗菌藥物進(jìn)一步作用下極易發(fā)展成高水平耐藥［1］。我們用濃度梯度法Etest法所測菌株中，所有耐藥菌gyrA基因均檢出突變位點(diǎn)。而2株敏感菌（MIC為1 μg／ml）及中介度的2株菌也出現了HinfⅠ酶切位點(diǎn)丟失，即gyrA該位點(diǎn)突變。這4例病人僅進(jìn)行了一次微生物學(xué)檢查，我們無(wú)法了解這幾株菌gyrA基因突變前的藥敏變化情況，以及我們檢出gyrA基因發(fā)生突變后是否演變成了高水平耐藥。但我們的結果表明，常規藥敏方法檢測的部分敏感菌或處在中介度的菌株出現gyrA基因突變，應引起臨床及實(shí)驗室足夠重視。用常規方法檢出這部分菌株，對控制低水平耐藥大腸埃希菌發(fā)展成對環(huán)丙沙星高水平耐藥菌有一定意義。
有關(guān)低耐大腸埃希菌HinfⅠ酶切位點(diǎn)發(fā)生突變后，是如何演變成高耐菌還有待進(jìn)一步探討。近年研究表明，其演變方式是由單位點(diǎn)逐步向多位點(diǎn)突變發(fā)展，導致DNA旋轉酶、細胞膜通透性發(fā)生變化，引起大腸埃希菌對環(huán)丙沙星高度耐藥［1］。當然并非大腸埃希菌gyrA基因發(fā)生突變就一定會(huì )引起對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥。Lehn等［2］研究表明包括喹諾酮類(lèi)耐藥大腸埃希菌和ATCC菌株在內，gyrA&127;基因某些位點(diǎn)發(fā)生突變（沉默基因），由于其編碼的氨基酸序列未發(fā)生改變，并不引起大腸埃希菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性。由此可見(jiàn)大腸埃希菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性的機理非常復雜，我們僅對臨床菌株gyrA基因突變情況進(jìn)行了探討，其意義在于了解臨床分離大腸埃希菌gyrA基因突變現狀，對控制大腸埃希菌耐環(huán)丙沙星有一定幫助。其他與耐藥有關(guān)的因素如菌株細胞膜通透性改變、大腸埃希菌對藥物的主動(dòng)排泄，以及gyrB基因等在產(chǎn)生耐藥性過(guò)程中是如何相互發(fā)揮作用的，均有待進(jìn)一步深入探討。
作者：張軍民 吳堅 趙莉萍 程彥國 劉梅 周貴民
單位：100853 北京，解放軍總醫院微生物科
參考文獻
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