葡萄組織培養（2）

（四）葡萄無(wú)病毒苗的鑒定和生產(chǎn)

從組織培養得到的葡萄無(wú)病毒苗，要經(jīng)過(guò)指示植物法等鑒定途徑，確認無(wú)病毒存在，才可以繁殖生產(chǎn)，推廣應用。

葡萄卷葉病毒尚無(wú)草本寄主。常用芽接指示植物，品種有Baco、Mission和Ln－33，其中以Ln－33反應較靈敏，有的每株嫁接后當年秋天發(fā)病，而 Mission需經(jīng)四年才表現癥狀。Ln－33易繁殖，易嫁接，抗霜霉病，無(wú)自然感染的黃點(diǎn)病，嫁接后只表現溫和癥狀，是現有的最好指示植物。葡萄黃點(diǎn)病指示植物有Ln－33、Baco－22A、Esparte和Mission，其中Esparte是最好的指示植物，春天嫁接，第二年秋天即出現癥狀。

經(jīng)過(guò)鑒定確實(shí)無(wú)病毒，則應建立葡萄種苗庫，由生產(chǎn)單位、技術(shù)部門(mén)分工協(xié)作，進(jìn)行系統的選育、檢驗和生產(chǎn)（圖12－2）。

　四、葡萄花粉（pollen）的培養

（一）葡萄花粉植株的培養

Gresshoff等（1974）進(jìn)行了歐亞種葡萄（Vitis　vinifera）的花藥培養，得到了單倍體愈傷組織。Hirabayashi等（1976）則研究了不同培養基和不同培養條件對花粉愈傷組織新梢分化的影響，發(fā)現在0～30℃的自然溫度，在NitSCh培養基培養，則有新梢和根的分化。鄒昌杰等（1981）研究了9個(gè)葡萄品種的花粉培養工作，從其中一個(gè)品種分化得到了植株。

（二）培養方法

取花粉單核靠邊期的花藥，該期的外部標志為花穗上密集的小花剛開(kāi)始分離，而花穗上退化葉葉尖未變褐時(shí)進(jìn)行接種。自田間取來(lái)的花穗先用自來(lái)水沖洗，以后在70％酒精中浸15s，再在飽和漂白粉澄清液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗3次后接種。以后暗培養，控溫26＋l℃。

誘導培養基為改良B5添加BA2mg／L，2，4－D0．5 mg／L ，蔗糖3％，瓊脂0．6％。分化培養基為改良B5添加BA 4mg／L ，NAA0．2mg／L ，蔗糖2％，瓊脂0．6％。成苗培養為MS（大量減半），添加BA 0．1 mg／L ，NAA（或1AA）0．01 mg／L，蔗糖 1～2％，瓊脂0．4％，PH值6．0。

花藥接種后 3d陸續變褐色（加活性炭的不變），接后12d可見(jiàn)花藥裂口處長(cháng)出愈傷組織，20～30d為生長(cháng)旺期。產(chǎn)生的愈傷組織可按其顏色和質(zhì)地分三類(lèi)：甲類(lèi)白色，質(zhì)地緊密而脆，球形，表面有顆粒狀突起；乙類(lèi)白色，疏松，球形不規則，有些品種呈紅色；丙類(lèi)淡黃色，松軟，生長(cháng)迅速，易老化。

（三）愈傷組織的誘導

1．不同品種的培養　鄒昌杰等（1977）進(jìn)行了17個(gè)葡萄品種夏梢花藥的誘導培養對比，愈傷組織的誘導率以巴娜蒂品種為最高，可達49．7％，其次紅香蕉為49．2％，而蜜爾紫品種的誘導率僅為3．75％。這是由材料本身的內在因素所決定的。

2．春梢和夏梢花的培養　葡萄具有一年多次開(kāi)花的習性，這給花藥培養提供了更多的培養機會(huì )。但由于春梢和夏梢生長(cháng)的季節不同，故材料素質(zhì)也不一樣，不同的品種表現也

不盡相同。如紅香蕉以春梢愈傷組織誘導率為高達47．1％，白蓮子則以夏梢為高，達20．8％（春梢由于花粉已過(guò)單核靠邊期，可能有一定的誤差存在）。

3．不同細胞分裂素的影響　從BA和KT不同細胞分裂素對葡萄不同品種（品系）花藥愈傷組織誘導培養的效果看，總的以BA的效果為好，大多品種誘導頻率皆較高，特別是甲類(lèi)愈傷組織的誘導率皆顯著(zhù)優(yōu)于KT。

4．椰乳的效果　培養基中添加椰乳對提高愈傷組織的誘導率有明顯的作用，皆可提高一倍左右。8％與12％相比以8％為優(yōu)，所以添加量太大也無(wú)益。

4．植株的分化

在葡萄勝利品種花藥誘導（誘導率為17．1％）中產(chǎn)生一種質(zhì)地硬而脆，表面大，顆粒狀，外形不規則，稍加外力易成碎塊，見(jiàn)光后迅速變綠的愈傷組織，增殖慢。以后轉移到分化培養基，出現器官分化。

愈傷組織開(kāi)始分化時(shí)，先在表面產(chǎn)生半透明的膠狀物，即分化大量的胚狀體，又分化少數肉質(zhì)芽。胚狀體長(cháng)至3～5mm時(shí)，轉入成苗培養基，連續光照數晝夜變綠，逐漸長(cháng)成植株。肉質(zhì)芽包埋在愈傷組織內，如早期剝離培養，也能長(cháng)成完整植株。

為使愈傷組織分化，只加入低劑量的細胞分裂素，無(wú)需生長(cháng)素。但在加有高劑量的細胞分裂素和低劑量生長(cháng)素的培養基上也能分化。

五、子房培養 (Ovary　Culture)

葡萄的子房培養無(wú)論對葡萄基礎生理的研究和園藝方面的應用皆有一定意義。

Nakagawa等（1983）進(jìn)行了葡萄子房培養的試驗，研究了一些生長(cháng)影響因子。

（一）分離培養　取開(kāi)花前兩天的花，經(jīng)滅菌后，小心地去掉花冠和雄蕊，而不要傷害子房，用小刀將子房從基部切下，接種到Nitsth培養基上。培養室保溫25℃，光照強度為2500Lx，每天照明12小時(shí)。

（二）有機添加物的作用? 有機添加物對培養子房的發(fā)育皆有促進(jìn)作用，依其作用大小依次為麥芽提取液、鮮葡萄汁、黃瓜汁和葡萄蔓葉。發(fā)現有的子房接種到鮮葡萄汁，幾周后會(huì )變褐死亡。

（三）生長(cháng)調節物質(zhì)的作用

葡萄子房培養在添加有植物生長(cháng)調節物質(zhì)的培養基中，可以促進(jìn)單性生長(cháng)，并在培養15周后在有些處理觀(guān)察到漿果變色的情況。

從培養子房的體積看，在基本培養基中添加有 BA0．2mg／L的處理，要超過(guò)對照（無(wú)激素）。子房體積最大的為添加BA 0．2mg／L、NAA 0．2 mg／L、GA31 mg／L及NAA、GA3、 BA三種激素的皆比對照小。

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