聚合酶鏈反應-反向斑點(diǎn)雜交鑒定分枝桿菌菌種

作者：李國利  莊玉輝  趙銘  王國治  陳保文  沈小兵  胡忠義  

摘　要　目的　建立一種簡(jiǎn)便、快速、敏感和特異的分枝桿菌菌種鑒定方法。方法　以16SrDNA為靶序列，采用聚合酶鏈反應(PCR)-反向斑點(diǎn)雜交檢測25種分枝桿菌、11種非分枝桿菌標準株、10株分枝桿菌臨床分離株和26份臨床痰標本。結果　分枝桿菌、非分枝桿菌標準株經(jīng)DNA擴增，分枝桿菌均出現578 bp DNA片段，非分枝桿菌除假白喉棒狀桿菌可見(jiàn)同樣片段外，其余菌種均未見(jiàn)擴增。敏感性試驗可檢測出100 fg結核分枝桿菌DNA。探針特異性試驗表明，17種寡核苷酸探針除pTub1、pFor1、pSme探針可見(jiàn)交叉雜交外，其余探針均是特異的。10株結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌臨床分離株PCR-反向斑點(diǎn)雜交結果與常規鑒定結果相符。26份涂片陽(yáng)性痰標本經(jīng)該法直接鑒定為結核菌復合體。結論　16SrDNA pCR-反向斑點(diǎn)雜交鑒定分枝桿菌菌種快速、有效，具有較高的應用價(jià)值。

　　關(guān)鍵詞：分枝桿菌，結核；聚合酶鏈反應；DNA探針

　　目前，國內外所采用常規的分枝桿菌菌種鑒定方法，操作復雜、費時(shí)，根據細菌生物學(xué)表型特征，采用十幾項指標綜合分析，需1～2個(gè)月方可獲得種的鑒定結果，難于滿(mǎn)足臨床診斷及治療的要求。迫切需要建立快速、可靠的分枝桿菌菌種鑒定方法。我們采用16SrDNA pCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，快速鑒定分枝桿菌菌種，具有較高的應用價(jià)值。

　　材料與方法

　　一、材料

　　1.菌株及標本來(lái)源：試驗所用25種分枝桿菌標準株(圖1)、11種非分枝桿菌標準株(表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、假白喉棒狀桿菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、卡他布蘭漢菌、大腸埃希菌、星形奴卡菌、紅色紅球菌)來(lái)源于中國藥品生物制品檢定所和中國科學(xué)院微生物研究所。4株結核、6株非結核分枝桿菌臨床分離株和26份臨床痰標本，分別來(lái)源于上海市疾病預防控制中心和本院結核科。臨床分離株已依據《全國結核病診斷細菌學(xué)檢驗規程》^［1］常規方法菌種鑒定。26份痰標本涂片抗酸染色分別為+～++++。

　　2.16S rDNA引物及寡核苷酸探針：根據已知的各種分枝桿菌菌種16S rDNA序列片段及文獻報道^［2-4］設計引物及17種分枝桿菌寡核苷酸探針。引物Ⅰ(5′端地高辛標記)和引物Ⅱ之間包括了16s rDNA 578 bp片段。引物及探針序列見(jiàn)表1。由上海生工生物工程有限公司合成。

　　二、方法

　　1.探針加尾：100 μl反應體系內5X末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)反應緩沖液20μl，dTTP終濃度1 mmol/L，探針終濃度2 μmol/L，TdT 80 U，加雙蒸水至100μl，混合后稍離心，置37℃水浴2 h，加0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)2 μl終止反應。

　　2.DNA提取及PCR擴增：參照文獻［5］提取標準菌株、臨床分離菌株及臨床痰標本DNA。在25μl反應體系內PCR擴增，10X PCR buffer 2.5 μl，引物Ⅰ、引物Ⅱ終濃度各為0.2μmol/L，4xdNTP終濃度各為0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，DNA模板10～20 ng或臨床痰標本DNA提取物2.5 μl，加雙蒸水至25 μl。置熱循環(huán)儀內94℃1 min，55℃2 min，72℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。72℃延伸7 min，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

表1　16srDNA引物及寡核苷酸探針序列

　　3.反向斑點(diǎn)雜交：(1)制膜：取加尾后的探針4～6 pmol按順序點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，置60℃干烤固定2 h。固定后的膜經(jīng)漂洗去除未固定的探針，可立即使用，也可待干燥后保存待用。(2)雜交：點(diǎn)有加尾探針的膜放入反應袋中。將地高辛標記的PCR產(chǎn)物煮沸5 min，冰浴5～10 min。在各反應袋中分別加入雜交液(5×SSC，1% blocking試劑，0.1%十二烷基肌氨酸鈉，0.02%SDS) 5 ml，再分別加入變性的PCR產(chǎn)物10～15μl，混勻，閉膜，55℃孵育30 min。(3)洗膜：洗液Ⅰ(2×SSC，0.1%SDS)室溫10 min洗2次，洗液Ⅱ(0.1×SSC，0.1%SDS)55℃10 min洗1次。(4)抗體結合：按說(shuō)明書(shū)稀釋抗地高辛抗體-堿性磷酸酶結合物(Anti-Digoxigenin-AP)，與雜交后的膜室溫作用30 min。(5)洗膜：緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5)室溫洗膜2次，每次10 min，緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl₂，pH9.5)室溫洗膜1次，5 min。(6)顯色：用BICP-NBT系統顯色，待DNA顯色，未出現本底時(shí)，用TE洗膜終止反應。結果

　　1.16S rDNA引物PCR的特異性及敏感性：引物Ⅰ和引物ⅡPCR擴增所試分枝桿菌和非分枝桿菌標準菌株，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分枝桿菌均可見(jiàn)一條578 bp DNA帶，而非分枝桿菌，除假白喉棒狀桿菌可見(jiàn)該DNA帶外，其余均未見(jiàn)擴增帶，表明用引物Ⅰ和引物Ⅱ擴增分枝桿菌16S rDNA有較好的屬特異性。取經(jīng)定量的結核分枝桿菌H₃₇RV株DNA依次稀釋為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg及1 fg/μl DNA，取1 μl DNA擴增，其檢測敏感性為100 fg。

　　2.16S rDNA寡核苷酸探針特異性：25種分枝桿菌標準株PCR擴增后反向斑點(diǎn)雜交結果見(jiàn)圖1。探針pMyc與所試分枝桿菌均雜交；探針pTub2、pKan與相應的復合體菌種雜交；探針pAvi、pInt、pScr、pMar、pSzu、pXen、pGor、pFor2、pChe、pTer、pNon只與相應菌種雜交。探針pTub1與土分枝桿菌和金色分枝桿菌、pFor1與不產(chǎn)色分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、pSme與微黃分枝桿菌可見(jiàn)交叉雜交。11種非分枝桿菌標準株擴增產(chǎn)物與17種分枝桿菌探針均不雜交。

　　3.臨床分離株及臨床標本檢測：采用PCR-反向斑點(diǎn)雜交檢測經(jīng)常規方法鑒定的4株結核分枝桿菌、6株非結核分枝桿菌(偶發(fā)分枝桿菌1株、堪薩斯分枝桿菌2株、胞內分枝桿菌3株)臨床分離株，除1株常規方法鑒定為胞內分枝桿菌，PCR-反向斑點(diǎn)雜交試驗鑒定為鳥(niǎo)分枝桿菌外，其余菌株鑒定結果相符合。

　26份抗酸染色陽(yáng)性痰標本直接進(jìn)行PCR-反向斑點(diǎn)雜交試驗，鑒定為結核分枝桿菌復合體。

　　討論

　　細菌rRNA按沉降系數分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌染色體基因中，它的內部結構由保守區及可變區兩部分組成^［6］。其分子內存在的可變區，顯示出細菌不同分類(lèi)等級水平上的特異性。目前，國外關(guān)于分枝桿菌16S rDNA片段序列信息研究較多^［3］，包括了臨床標本可見(jiàn)到的多種分枝桿菌菌種。

　　我們最初試驗中選擇的pTub1、pFor1除與相應菌種雜交外，與其他分枝桿菌可見(jiàn)雜交。交叉雜交可能是由于種特異探針與其他分枝桿菌菌種16S rDNA相應區之間錯配核苷酸數量少造成的。此外，錯配的位置可能也影響結果，例如，土分枝桿菌PCR產(chǎn)物與pTub1有3個(gè)核苷酸錯配，與該探針雜交，而海分枝桿菌PCR產(chǎn)物與pTub1僅有2個(gè)核苷酸錯配，但與該探針并無(wú)雜交，海分枝桿菌PCR產(chǎn)物和pTub1錯配核苷酸之間間隔有6個(gè)核苷酸，而土分枝桿菌PCR產(chǎn)物與pTub1錯配核苷酸之間間隔則是11個(gè)核苷酸，文獻報道^［4］配對核苷酸連續長(cháng)度達到10個(gè)以上即可產(chǎn)生交叉雜交。因此我們重新設計了pTub2和pFor2，提高了檢測的特異性。pKan為堪薩斯-胃-瘰疬復合體探針，與堪薩斯、胃、瘰疬分枝桿菌均雜交，這是由于pKan選擇于16SrDNA可變區A區內，該探針與此區內堪薩斯、胃、瘰疬分枝桿菌相應DNA序列相同，故試驗同時(shí)在16s rDNA可變區B區內設計了瘰疬分枝桿菌探針pScr，瘰疬分枝桿菌與pKan和與pScr均雜交，堪薩斯-胃分枝桿菌復合體只與pKan雜交，據此我們可以將其相互鑒別。胃分枝桿菌雖與pKan雜交，但胃分枝桿菌為非致病性分枝桿菌，且胃分枝桿菌為不產(chǎn)色菌，堪薩斯分枝桿菌為光產(chǎn)色菌，我們可以參照菌落色素的不同，對兩者進(jìn)行鑒別。鳥(niǎo)、胞內分枝桿菌同屬RunyonⅢ群分枝桿菌，生物學(xué)表型特征極為相似，常規方法很難區別，多稱(chēng)其為鳥(niǎo)-胞內分枝桿菌復合體。我們根據DNA遺傳信息差別設計的寡核苷酸探針，可以將兩者鑒別。

　　在實(shí)際應用中，可先將pMyc與pTub2聯(lián)合使用，初步將結核與非結核分枝桿菌鑒別開(kāi)，如疑為非結核分枝桿菌，再用一系列特異探針進(jìn)行菌種鑒定。該方法為PCR與探針技術(shù)相結合，不僅可用于分離菌株及早期液體培養物鑒定。其最大的優(yōu)點(diǎn)是可用于臨床標本的直接檢測及鑒定。我們用26份抗酸染色陽(yáng)性痰標本的初步試驗，證明該方法是可行的，在接收標本后48 h內即可報告結果，我們將繼續深入研究該方法的應用價(jià)值。

　　作者單位：李國利(100091北京，解放軍第三○九醫院結核中心研究室)

　　莊玉輝(100091 北京，解放軍第三○九醫院結核中心研究室)

　　趙銘(100091 北京，解放軍第三○九醫院結核中心研究室)

　　王國治(中國藥品生物制品檢定所)

　　陳保文(中國藥品生物制品檢定所)

　　沈小兵(中國藥品生物制品檢定所)

　　胡忠義(上海市疾病預防控制中心)

　　參考文獻

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