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作者熊禮寬 楊應周 莊玉輝
近年來(lái)，醫源性速生長(cháng)分枝桿菌(Rapidly growing mycobacteria,RGM)感染暴發(fā)流行的報道日益增多，如手術(shù)傷口、器官移植、透析和注射后皮下感染等［1-4］。特別是龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌等感染。龜分枝桿菌最初由Friedman于1903年從柏林動(dòng)物園中的龜甲中分離出來(lái)，由于其生長(cháng)速度快，故屬于RGM中的一種。龜分枝桿菌最初定名為偶發(fā)—龜型復合物，直到1955年Gordon等對其詳細描述后，才將龜分枝桿菌單獨定為一個(gè)種，1972年將其分為3個(gè)亞種：龜分枝桿菌龜亞種（M. chelonae subs.chelonae,以前又稱(chēng)M.borstelense）、龜分枝桿菌膿腫亞種（M. chelonae subs.abscessus,以前又稱(chēng)M.abscessus,M.runyonii,M.piscium和M.fridmanii）和類(lèi)龜分枝桿菌（M.chelinae-like organisms,又稱(chēng)M.Mucogenicum）［1］。
龜分枝桿菌是一種常見(jiàn)的環(huán)境腐物寄生菌，廣泛分布于水和醫院的灰塵中，故它是分枝桿菌醫源性感染最常見(jiàn)的菌種之一。盡管文獻報道有些龜分枝桿菌菌株對磺胺、紅霉素等敏感［4］，但多數菌株對常見(jiàn)抗結核藥物耐藥。一旦感染，其臨床上治療比較困難，故應盡早明確診斷，控制醫源性暴發(fā)流行。
一、涂片染色檢查
自從1882年Koch發(fā)現結核分枝桿菌以來(lái)，涂片抗酸染色一直是臨床上檢查抗酸桿菌的首選方法，它包括直接涂片染色和濃縮集菌后涂片染色兩種方法，染色方法以萋納抗酸染色法為主［3］。尚有熒光染色法：金胺O染色法和吖啶橙染色法，由于熒光染色法采用高倍顯微鏡檢查，陽(yáng)性率高于抗酸染色，已被越來(lái)越多的實(shí)驗室所接受［5］。當疑為分枝桿菌感染時(shí)（如久治難愈的傷口等），取傷口分泌物或痰液，首先應涂片染色檢查分枝桿菌，同時(shí)進(jìn)行分枝桿菌培養。
二、培養
盡管分枝桿菌培養基種類(lèi)很多，但初代培養首選培養基為改良羅-瓊(Lowenstein-Jensen)培養基，有條件的實(shí)驗室可選用7H12B培養基(Becton dickinson公司)或變色液體培養基 (深圳市怡百世生物技術(shù)有限公司、MB-Redox biotest公司)，它們適用于臨床上各種標本分離培養分枝桿菌，如痰、膿液、分泌物等。當傷口分泌物疑為RGM感染所致，綜合性醫院實(shí)驗室可采用血液瓊脂平板培養基或麥康凱(MacConkey)瓊脂平板培養基(無(wú)氯化鈉)分離培養［1，5，6］，尤其適用于除痰以外的其他標本。由于龜分枝桿菌廣泛存在于環(huán)境中，常表現為一過(guò)性，從痰中較易分離出來(lái)，但并不表示龜分枝桿菌所致呼吸道感染，必須連續3次分離出同1菌株，依據非結核分枝桿菌病診斷標準，方可診斷為龜分枝桿菌感染。
三、生物學(xué)鑒定
1.龜分枝桿菌
2.當確定為RGM后，應進(jìn)行芳香硫酸酯酶（3 d、14 d）試驗、硝酸鹽還原試驗、鐵吸收試驗、麥康凱瓊脂生長(cháng)試驗和
3.待鑒定為龜分枝桿菌后，進(jìn)行5%氯化鈉耐受試驗、2%苦味酸耐受試驗、碳源（枸櫞酸鹽、甘露醇和肌醇等）底物利用試驗，以鑒別龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種和類(lèi)龜分枝桿菌［7］。在進(jìn)行生物學(xué)鑒定時(shí)，對于菌齡、菌量、溫度、氣體等都應標準化。如龜分枝桿菌進(jìn)行5%氯化鈉耐受試驗時(shí)，菌齡為對數生長(cháng)期，菌量為1McFarland單位，溫度為
此外，高壓液相色譜分析分枝菌酸也可用作龜分枝桿菌鑒定的輔助指標［8］。
四、分子生物學(xué)鑒定
1.隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)：RAPD又稱(chēng)任意引物PCR。Williams最先使用的引物為9～10個(gè)bp，但RAPD技術(shù)現在采用的引物多為1條10～25個(gè)bp寡核苷酸序列，能在基因組DNA的長(cháng)鏈中多處特異性的結合，因而產(chǎn)生相應數量的擴增片段。由于DNA序列上個(gè)別堿基的不同，如果發(fā)生在隨機引物結合部位則改變擴增片段的數量，如果發(fā)生在引物結合部位之間，則改變某些擴增片段的長(cháng)度，產(chǎn)生不同的DNA圖譜。Linton等［9］在進(jìn)行結核分枝桿菌DNA多態(tài)性分析時(shí)發(fā)現，引物長(cháng)度為20個(gè)堿基最佳，他們同時(shí)篩選了40條引物，結果發(fā)現MTBC-RF、INS-2和IS986-FP引物能較好的用于結核分枝桿菌分型。Zhang等［10］篩選了10條引物用于龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種分型，結果表明OPA2、OPA18、INS-2和IS986-FP引物較好。Lai等［11］同樣采用OPA2、OPA18、INS-2和IS986-FP引物鑒定龜分枝桿菌膿腫亞種所致的醫源性感染也取得了滿(mǎn)意的結果。我們的研究結果與此一致［12］，但是，為了獲得較好的重復性，模板最好采用標準酚-氯仿抽提法或DNA提取試劑盒，模板存放時(shí)間不要太長(cháng)，模板DNA濃度在0.3～1.0μg時(shí)，相應的引物濃度為1.6～6.4 μmol/L，鎂離子濃度為2～2.5 mmol/L。
2.脈沖瓊脂電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE):盡管PFGE已經(jīng)代替質(zhì)粒圖譜（技術(shù)復雜）作為RGM DNA指印的主要方法，但約有50%的龜分枝桿菌膿腫亞種通過(guò)此法不能得到正確的結果［2，13］。Lai等［11］采用DraⅠ、XbaⅠ、AseⅠ和SpeⅠ消化龜分枝桿菌膿腫亞種染色體總DNA，進(jìn)行PFGE，其結果不令人滿(mǎn)意。Zhang等［10］采用DraⅠ、XbaⅠ或AsnⅠ消化龜分枝桿菌染色體總DNA，進(jìn)行PFGE，結果9株龜分枝桿菌龜亞種PFGE圖譜尚可，但118株龜分枝桿菌膿腫亞種只有46株結果令人滿(mǎn)意。
3.PCR-限制性酶切圖譜分析（PCR-restriction enzyme pattern analysis,PRA）：PRA是根據PCR擴增分枝桿菌屬共有的分子量65 000熱休克蛋白（heat shock protein,hsp-65）基因，產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)惹忻赶�，電泳后而形成的圖譜分析，檢測和鑒定分枝桿菌，用于診斷結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌感染。Wilson等［14］擴增hsp-65基因中439 bp片段，擴增片段經(jīng)限制性?xún)惹忻?SPAN lang=EN-US>BstEⅡ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ、BsaHⅠ（必要時(shí)使用AciⅠ、HhaⅠ、NarⅠ）消化，293株需氧放線(xiàn)菌（其中170株分枝桿菌）中274株得到了正確鑒定。Steingrube等［15］擴增hsp-65基因中439 bp片段，擴增片段經(jīng)限制性?xún)惹忻?SPAN lang=EN-US>HaeⅢ和/或BstEⅡ消化，24株龜分枝桿菌膿腫亞種、16株龜分枝桿菌龜亞種和20株類(lèi)龜分枝桿菌，正確鑒定率分別為96、94和100%。我們按照Steingrube等［15］報道的方法對7株導致醫源性感染的龜分枝桿菌膿腫亞種進(jìn)行鑒定，證實(shí)可能為同一菌株所致的醫源性感染。此外，還有應用其它的靶基因序列進(jìn)行PRA分析，如IS6110、16SrRNA、23 srRNA或16S-23SrRNA間隔序列。
五、藥物敏感試驗
龜分枝桿菌藥物敏感試驗方法有瓊脂擴散法、絕對濃度法和Mueller-Hinton肉湯稀釋法等［16-20］。治療龜分枝桿菌感染主要依靠藥敏試驗選擇藥物及手術(shù)清創(chuàng )。龜分枝桿菌多對常見(jiàn)的抗結核藥物耐藥，一旦確定為龜分枝桿菌，則不必再做常規抗結核藥物敏感試驗［1］。Wallace等［16］研究表明：龜分枝桿菌龜亞種（59株）均對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁和頭孢美唑耐藥，61%的菌株對亞胺培南耐藥；龜分支桿菌膿腫亞種（141株）對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁和頭孢美唑耐藥率分別為67%、13%和24%，亞胺培南耐藥率為43%�？死顾厥且环N類(lèi)似與阿齊霉素的大環(huán)內酯抗生素，已廣泛用于治療RGM感染。Villanueva等［2］單用克拉霉素治療35例龜分枝桿菌膿腫亞種感染者，治愈率為23%；手術(shù)聯(lián)合克拉霉素治療148例龜分枝桿菌膿腫亞種感染者，治愈率達95%。盡管如此，在美國1990～1995年期間800例龜分枝桿菌感染者中，已有12例龜分枝桿菌膿腫亞種和6例龜分枝桿菌龜亞種感染復發(fā)者，克拉霉素MIC≥16μg/ml，其中已證實(shí)13例為23sRNA peptidyltransferase 點(diǎn)突變，即2058（38%）或2059（62%）位A變成了G或C［16］。關(guān)于克拉霉素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢西丁、妥布霉素和阿米卡星的MIC，不同的菌株差異較大［19，20］。
作者單位：熊禮寬(518020深圳市慢性病防治院肺部疾病研究所檢驗科)
楊應周(518020 深圳市慢性病防治院肺部疾病研究所檢驗科)
莊玉輝(解放軍第三○九醫院全軍結核病研究中心)
參考文獻
1，熊禮寬.龜分支桿菌龜亞種的分離與鑒定.臨床檢驗雜志,1995,13:82-83.
2，Villanueva A,Calderon RV,Vargas B,et al. Report on an outbreak of postinjection abscesses due to Mycobacterium abseceeus,including management with surgery and claritromycin therapy and comparison of strains by random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction.Clin Infect Dis,1997,24:1147-1153.
3，熊禮寬.綜述.結核病細菌學(xué)和免疫學(xué)診斷的研究進(jìn)展.國外醫學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,1987,8:13-16.
4，Singh N,Yu L.Successful treatment of pulmonary infection due to mycobacterium chelonae:case report and review.Clin Infect Dis, 1992,14:156-161.
5，熊禮寬.編著(zhù).結核病的實(shí)驗室診斷及其進(jìn)展.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1992:3-73.
6，Conville PS, Witebsky FG. Variables affecting results of sodium chloride tolerance test for identification of rapidly growing mycobacteria.J Clin microbil,1998,36:1555-1559.
7，Wallace RJJAr, Silcox VA, Tsukamura M, et al.Clinical significance,biochemical features,and susceptibility patterns isolates of the mycobacterium chelonae-like organism.J Clin Microbiol,1993,31:3231-3239.
8，Bosne S, Levy-Frebault VV. Mycobactin analysis as an aid for the identification of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonae subspecies.J Clin Microbiol,1992,30:1225-1231.
9，Linton CJ,Jalal H,Leeming JP ,et al.Rapid discrimination of Mycobacterium tuberculosis strains by random amplified polymorphic DNA analysis.J Clin microbiol, 1994,32:2169-2174.
10，Zhang Y, Rajagopalan M,Brown BA,et al.Randomly amplified polymorphic DNA pCR for comparison of Mycobacterium abscessus strains form nosocomial outbreaks.J Clin Microbiol, 1997,35:3132-3139.
11，Lai K, Brown BA, Westerling JA, et al. Long-term laboratory contamination by Mycobacterium abscessus resulting in two pseudo-outbreaks:recognition with use of random amplified polymorphic DNA(RAPD) polymerase chain reaction. Clin infect Dis, 1998,28:169-175.
12，Yingzhou Y, Likuan X. Randomly amplified polymorphic DNA PCR of mycobacterium abscessus strains. 20th Eastern Region Conference of the international Union Against tuberculosis & Lung Disease, 1999, 185.
13，Wallace RJ JAr, Zhang Y,Brown BA,et al.DNA large restriction fragment patterns of sporadic and epidemic nosocomial strains of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus. J Clin Microbiol, 1993,31:2697-2701.
14，Wilson RW,Steingrube VA, Brown BA, et al. Clinical application of PCR-restriction enzyme pattern analysis for rapid identification of aerobic actinomycete isolates. J Clin Microbil, 1998,36:148-152.
15，Steingrube VA，Gibson JL, Brown BA, et al. PCR amplification and restrication endonuclease analysis of a 65-kilodalton heat shock protein gene sequence for taxonomic separation of rapidly growing mycobacteria.J Clin microbiol,1995,33:149-153.
16，Wallace RJ, Brown BA, Onyi GO. Susceptibilities of Mycobacterium fortuitum biovar. fortuitum and the two subgroups of Mycobacterium chelonae to imipenem, cefmetazole, cefoxitin, and amoxicillin-clavulanic acid. Antimicrob Agents chemother, 1991,35:773-775.
17，Wallace RJ,Meier A, Brown BA,et al.Genetic basis for clarithromycin resistance among isolates of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus. antimicrob Agents Chemother, 1996, 40:1676-1681.
18，熊禮寬.楊應周.王仕洪，等.氧氟沙星和環(huán)丙沙星對快速生長(cháng)分支桿菌最低抑菌濃度測定.中國防癆雜志,1995,17:24-25.
19，Hoffner SE,Klintz L, Olsson-Liljequist B,et al.Evaluation of Etest for rapid susceptibility testing of Mycobacterium chelonae and M.fortuitum.J Clin microbiol,1994,32:1846-1849.
20，Woods GL, Bergmann JS,Witebsky FG,et al.Multisite reproducibility of results obtained by the broth microdilution method for susceptbility testing of mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae,and Mycobacterium fortuitum. J clin Microbiol,1999,37:1676-1682
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