培養基成分對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響

【摘要】  　　目的研究MS培養基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)及生物堿含量的影響，篩選有利于彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)和生物堿積累的培養基配方。方法采用正交和單因素實(shí)驗設計，以生長(cháng)40 d的彭澤貝母愈傷組織的生長(cháng)率和生物堿含量為指標，評價(jià)各因素對其影響的大小。結果各因素對彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)影響大小依次為P>Ca>K>N,對生物堿積累影響大小依次為K>N>Ca>P；培養基中NO3-N含量較高時(shí)，有利于生物堿的積累；微量元素缺乏時(shí)均有利于彭澤貝母愈傷組織的生長(cháng)，缺Cu、缺I時(shí)不利于生物堿的積累。結論有利于彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)和生物堿積累的最佳組合分別為：N3P1K3Ca2、 N1P2K3Ca1；培養基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)及生物堿含量存在一定影響。

【關(guān)鍵詞】  彭澤貝母 愈傷組織 生長(cháng)量 生物堿

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of large elements, trace elements of MS culture medium on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus ,and to select the culture medium which is advantageous in its growth and alkaloid accumulation.MethodsWith the growth rate and alkaloid content of the 40 days' callus as indexes, single-factor and orthogonal experimental design  was conducted to evaluate the impact of various factors.ResultsThe effect of various factors on the growth of the callus is P>Ca>K>N ,and on the alkaloids was K>N>Ca>P; the alkaloid content was higher when the proportion of NO3-N was higher than NH+4-N；Lacing trace elements were all advantageous in growth of the callus，but lacing I and Cu were not helpful to the accumulation of alkaloids. ConclusionThe best combination of the various factors for the growth and the accumulation of alkaloids of the callus respectively is: N3P1K3Ca2、 N1 P2 K3Ca1； large elements, trace elements of MS culture medium have effects on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus.

　　Key words：Fritillaria monantha Migo;   Callus;   Alkaloids ;   Growth
   
　　江西彭澤貝母Fritillaria monantha Migo主產(chǎn)于江西北部的彭澤、湖口、都昌、九江、瑞昌、修水等縣，已被確定為國產(chǎn)貝母屬植物在江西的新分布,彭澤貝母作川貝母使用已有多年的歷史，現代藥理學(xué)研究表明，彭澤貝母的藥理、藥效接近甚至優(yōu)于幾種常用貝母。近年來(lái)，其需求量增大，人們過(guò)度采挖，導致其野生蘊藏量銳減，加上人工栽培條件嚴格，有性繁殖年限長(cháng)，無(wú)性繁殖系數低，病蟲(chóng)害防治難等，不能滿(mǎn)足人們長(cháng)期用藥的需求。隨著(zhù)近年來(lái)對植物生物化學(xué)研究的深入，利用植物細胞、組織或器官培養獲得并優(yōu)化藥用植物次生代謝產(chǎn)物，以及最終利用遺傳工程制取次生代謝產(chǎn)物以滿(mǎn)足人類(lèi)對藥用植物的巨大需求，已成為當前藥用植物生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大規模藥用植物組織培養技術(shù)的成功，使藥用植物組織細胞培養技術(shù)在中藥領(lǐng)域得到了更深的研究和應用。本課題組研究了不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導的影響，并對其高產(chǎn)細胞做了篩選［1，2］。本文在此基礎上研究了MS培養基中無(wú)機成分對其生長(cháng)及生物堿含量的影響，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

　　1  材料與儀器

　　1.1  材料為本實(shí)驗室繼代培養的疏松的彭澤貝母愈傷組織。

　　1.2  藥品貝母素甲購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110750-200607；氯仿、甲醇、氨水、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純。

　　1.3  儀器UV7501紫外/可見(jiàn)分光光度計（無(wú)錫科達儀器廠(chǎng)）；SW-CJ-2F醫用凈化工作臺（上海博訊）；PB303-N電子天平（瑞士梅特勒）；全自動(dòng)高壓蒸氣滅菌鍋（上海博訊）等。

　　2  方法

　　2.1  培養條件以MS為基本培養基，NAA 2.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+KT 0.5mg/L為激素組合置于溫度（20±1）℃，光照強度為1 000-1 500lx，濕度為100%光照培養箱內培養。

　　2.2  生長(cháng)量測定接種和取材前后均稱(chēng)量培養基的重量,計算接種量、收獲量和增長(cháng)率（每個(gè)處理3瓶）：接種量=接種后瓶重(g)-接種前瓶重(g)，收獲量=收獲前瓶重(g)-收獲后瓶重(g)，生長(cháng)率（%）=收獲量(g)×100／接種量(g)。

　　2.3  對其生長(cháng)及生物堿含量的影響以N，P，K，Ca為4個(gè)因素，MS培養基中原濃度、1/2濃度、1/4濃度3個(gè)水平，采用正交設計L9(34)進(jìn)行實(shí)驗（見(jiàn)表1），培養40 d后取出材料，測定生長(cháng)率和生物堿含量。表1  N，P，K，Ca含量正交設計因素水平表（略）

　　2.4  NH4+-N與NO3-N對愈傷組織生長(cháng)及生物堿含量的影響培養基中的氮源改用KNO3和NH4Cl，總N濃度不變，研究其不同比例對彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)及生物堿含量的影響，處理見(jiàn)表2。表2  銨態(tài)N與硝態(tài)N對其生長(cháng)及生物堿含量的影響（略）

　　2.5  微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)及生物堿含量的影響以MS培養基為對照，把彭澤貝母愈傷組織接種到分別不加Fe，Mn，B，Mo，Zn，I，Co，Cu的培養基上，培養40 d后，取出材料測定生長(cháng)率和生物堿含量。

　　2.6  生物堿的提取與含量測定生物堿的提取與含量測定參考劉紅寧［3］、上官一平［4］等的方法，并在此基礎上做了改進(jìn)。

　　2.6.1  試劑的配制pH 5.0鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液：稱(chēng)取4 g鄰苯二甲酸氫鉀，加熱溶解并定容至100 ml，用0.2 mol/L NaOH溶液調至pH 5.0。

    0.04%溴甲酚綠溶液配制：精密稱(chēng)取溴甲酚綠80 mg，加入少量1 mol/L NaOH溶液溶解，定容至200 ml,置陰暗處備用。

　　2.6.2  標準溶液的配制精密稱(chēng)取浙貝甲素0.006 3 g置于25 ml容量瓶中，加氯仿溶解，定容，得浙貝甲素標準溶液。

　2.6.3  標準曲線(xiàn)的制備精密吸取浙貝甲素標準液1，3，5，7，9 ml，用氯仿定容至10 ml,分別置分液漏斗中，加水10 ml，溴甲酚綠溶液2 ml和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液2 ml，再精密加入三氯甲烷20 ml，密塞，搖勻，靜置30 min，分取氯仿層。另取氯仿10 ml，同法操作，所得氯仿層為空白，在411 nm波長(cháng)處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)，得回歸方程Y=12.071X+0.100 5,R2=0.998 8。見(jiàn)圖1。

　　2.6.4  最大吸收波長(cháng)選擇取1 ml標準溶液萃取的氯仿層，照紫外-可見(jiàn)分光光度法在200～800 nm波長(cháng)范圍內進(jìn)行掃描，此對照品在411 nm波長(cháng)處有最大吸收峰，故選擇411 nm為測定波長(cháng)。
　　
　　2.6.5  樣品處理取彭澤貝母愈傷組織于60℃干燥至恒重，粉碎，過(guò)4號篩，精密稱(chēng)取貝母粉末0.5 g，用10%氨水2 ml濕潤30 min，加混合溶劑（氯仿∶甲醇=4∶1）20 ml超聲提取40 min，過(guò)濾，濾液于60°C水浴蒸干，再用氯仿溶解，置分液漏斗中，加水10 ml，溴甲酚綠溶液2 ml和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液2 ml，再精密加入三氯甲烷（總30 ml），密塞，搖勻，靜置30 min，分取氯仿層，并定容至50 ml,另取氯仿30 ml，同法操作，所得氯仿層為對照。

　　3  結果

　　3.1　培養基中N、P、K、Ca含量對愈傷組織生長(cháng)及生物堿含量的影響見(jiàn)表3。從表3可以看出，處理7愈傷組織增長(cháng)率最大, 為108.42%,處理3最小,僅為38.11%；而生物堿含量最高的為處理3,含量為0.163%,最小的為處理4，僅為0.04%。通過(guò)直觀(guān)極差比較可知，RP>RCa>RK>RN，RK′>RN′>RCa′>RP′，表明各因素中對彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)的影響大小依次為P>Ca>K>N，而對生物堿積累影響大小則為K>N>Ca>P，有利于彭澤貝母愈傷組織生長(cháng)的最佳組合為：N3P1K3Ca2，有利于彭澤貝母愈傷組織生物堿積累的最佳組合為：N1 P2 K3Ca1。表3  N、P、K、Ca含量對其生長(cháng)及生物堿含量的影響（略）

　　3.2  銨態(tài)N與硝態(tài)N對愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見(jiàn)表4。從表4可以看出,處理5彭澤貝母愈傷組織的平均增長(cháng)率最高為88.92%,即 NH4+/N03-為1/2時(shí)，其次為處理3為83.08%,即 NH4+/N03-為2/1時(shí)，當培養基中僅為NH4+-N時(shí)，增長(cháng)率只有8.68%，增長(cháng)率最小的為空白對照，僅為4.67%；當NH4+/N03-為1/2時(shí)生物堿含量最高，達到0.164%，培養基中NH4+/N03-為1/2、1/4、僅N0-3-N時(shí)，生物堿含量均高于其他處理，在空白對照中生物堿含量最低。由此表明Ｎ源對彭澤貝母愈傷組織的生長(cháng)分化及生物堿的積累是有一定影響的，只有當不同形態(tài)的Ｎ源比例適宜時(shí)，才有利于愈傷組織的增殖和生物堿的積累。表4  銨態(tài)N與硝態(tài)N對其生長(cháng)及生物堿含量的影響（略）

　　3.3  微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見(jiàn)圖2～3。從圖中可以看出，缺乏微量元素均有利于彭澤貝母愈傷組織的增殖，其中缺Co時(shí)增長(cháng)率達到128.19%，生物堿含量遠遠高于對照；缺Zn、缺Fe時(shí)生物堿含量最高，達到了0.234%，缺I、缺Cu不利于生物堿的積累。

　　4  討論
   
　　培養基的組成是植物生長(cháng)的一個(gè)決定因素，不同植物對培養基有不同的要求，并對培養基中的不同成分有不同的敏感性。本試驗發(fā)現，當MS培養基中NO-3-N的比例增高時(shí)有利于彭澤貝母愈傷組織中生物堿的積累。
   
　　微量元素在植物細胞生長(cháng)中起著(zhù)不可替代的作用，它們大多是酶的組成成分或活化劑，缺少其中一種就會(huì )代謝受阻，但是植物對其的需要量甚微，稍多就發(fā)生毒害。本文研究發(fā)現當培養基中缺B、缺Zn、缺Cu、缺Mo、缺Co、缺Mn、缺Fe、缺I時(shí)均有利于彭澤貝母愈傷組織的生長(cháng)，但是缺Cu、缺I時(shí)不利于生物堿的積累，與近幾年研究的植物逆境有利于中藥有效成分的積累相一致［5］。

【參考文獻】
  　�。�1］張壽文,劉賢旺, 黃慧蓮，等.不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導效應的研究［J］.江西中醫學(xué)院學(xué)報,2004, 16(4):52.

　�。�2］張壽文,雷志強,劉華，等.彭澤貝母組織培養和高產(chǎn)細胞系篩選研究［J］.江西農業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,29(1):152.

　�。�3］劉紅寧, 顏冬梅,朱衛豐，等.HPLC-ELSD測定彭澤貝母中浙貝甲素和浙貝乙素［J］.中草藥，2006,37(4):600.

　�。�4］上官一平,傅靜芝.酸性染料比色法測定川貝母中貝母素甲含量［J］.中南藥學(xué),2006，4(2):130.

　�。�5］黃璐琦,郭蘭萍.環(huán)境脅迫下次生代謝產(chǎn)物的積累及道地藥材的形成［J］.中國中藥雜志,2007,32(4):277

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