無(wú)血清培養基與完全培養基體外誘導擴增 CIK細胞分泌細胞因子水平的比較

錄入時(shí)間:2010-11-26 10:00:03 來(lái)源：中國論文下載中心

【摘要】  目的比較無(wú)血清培養基（AIMV）與完全培養基（CM）體外誘導擴增CIK細胞及CIK細胞分泌細胞因子水平。方法分別用AIMV及完全培養基加入4種細胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)將臍帶血單個(gè)核細胞(CBMNCs)誘導成CIK細胞，比較細胞的增殖能力、細胞表型及分泌細胞因子水平。結果與完全培養基比較，無(wú)血清培養基培養的CIK細胞增殖高峰較晚(14～17天),但增殖倍數高，在細胞表型、分泌細胞因子水平方面兩種培養基培養的CIK細胞均無(wú)明顯的差別（P＞0.05）。結論無(wú)血清培養基可代替完全培養基。
【關(guān)鍵詞】  無(wú)血清培養基免疫細胞培養細胞因子腫瘤
   0  引言
    CIK細胞（Cytokineinduced killer，CIK）是將人外周血單個(gè)核細胞，在體外用多種細胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培養一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細胞。具有極強的增殖能力及殺傷腫瘤細胞的能力。Critzapis等[1]報道，CIK細胞分泌多種細胞因子進(jìn)一步提高免疫效應細胞的細胞毒作用從而殺傷腫瘤細胞。治療所需的CIK細胞在體外培養時(shí)所用的條件對細胞的活性有很大影響�，F在常用于細胞培養的完全培養基,因含有人AB血清,雖經(jīng)HBV、HCV及HIV的檢測,但仍有可能傳播其他疾病,安全性低;并且存在批次差異、不宜質(zhì)控，質(zhì)量不能保證。無(wú)血清培養基則可達到生物潔凈要求,成分明確,質(zhì)量穩定,便于質(zhì)控,克服了人ＡＢ血清的缺點(diǎn),能減少病人意外感染的機會(huì )，對于免疫治療的推廣應用有重要意義。為此,我們比較了無(wú)血清培養基（ＡＩＭＶ）與完全培養基(含10%胎牛血清RPMI 1640)培養CIK細胞分泌細胞因子水平。
    1  材料與方法
    1.1  材料
    健康足月產(chǎn)胎兒臍帶靜脈血50ml(枸櫞酸鈉抗凝),產(chǎn)婦各項生化指標檢測正常。RPMI1640培養基、淋巴細胞分離液和無(wú)血清培養基購自GIBCO公司,細胞因子購自Bioscience公司, 流式試劑CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITC CD16+CD56PE和PI染液購自BeckmanColuter公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司。
    1.2  方法
    1.2.1  細胞培養
    臍血用淋巴細胞分離液作密度梯度2500r/min離心30min分離的外周血單個(gè)核細胞, 分別用完全培養基(RPMI 1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ鏈霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和無(wú)血清培養基調整細胞數為1×106個(gè)/ml,接種于24孔培養板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ 1 000u/ml,培養24h后加入rhIL2 300u/ml、rhIL1 100u/ml及OKT 350ng/ml繼續培養,每隔4d更換培養基,調細胞數為1×106個(gè)/ml,補加rhIL2 300u/ml,每8d在補加rhIL2的同時(shí)補加OKT 350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640常規培養。設不加細胞因子的CBMNCs培養作為對照。
    1.2.2  細胞表型分析
    于培養的第0、4、8、10、12、14、17、21d對以上各組效應細胞進(jìn)行分析,每組每次測4個(gè)復孔。
    1.2.3  細胞增殖能力測定
    于培養的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞用臺盼藍拒染法計數所培養的活細胞濃度,根據流式檢測的CIK的比例，計量液量,推算CIK細胞總數。
    1.2.4  CIK細胞分泌IL2、IFNγ、TNFα細胞因子水平測定
    于培養的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞,充分洗滌,調整細胞濃度為2×106/ml培養24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量測定細胞培養上清中IL2、IFNγ、TNFα，設4個(gè)平行孔。
    2  結果
    2.1  ＡＩＭＶ與完全培養基培養CIK細胞增殖能力的比較
    實(shí)驗表明,ＡＩＭＶ培養細胞較完全培養基培養細胞增殖遲緩。完全培養基增殖高峰期在第12d，增殖平臺為第10～12d，最高增殖倍數為638.4倍；而ＡＩＭＶ培養基增殖高峰期在第14d，增殖平臺為第14～17d，最高增殖倍數為678.7倍。雖然ＡＩＭＶ培養細胞較完全培養基培養細胞增殖遲緩，但其增殖平臺期較長(cháng)，增殖倍數較完全培養基高，見(jiàn)圖1。
    圖1  AIMV與完全培養基培養CIK細胞增殖能力
    2.2  ＡＩＭＶ與完全培養基培養細胞表型比較
    實(shí)驗結果表明，兩種培養基培養的細胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+細胞所占百分比逐漸增多，CD3+CD56+細胞在ＡＩＭＶ培養基中，增長(cháng)高峰在14～17d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（31.53±1.65）,增長(cháng)了150.14倍，完全培養基增長(cháng)高峰在12～14d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（30.90±2.28），增長(cháng)了147.14倍。對照組CBMNCs培養體系中未出現明顯的細胞表型轉化,各種細胞成分均呈遞減趨勢，見(jiàn)表1、圖2。
    2.3  AIMV與完全培養基培養的CIK細胞分泌細胞因子水平
    2.3.1  IL2水平
    AIMV與完全培養基培養的CIK細胞均分泌IL12，從第4d分泌量均穩定升高，都于12d達到高峰，第14d略有下降為，以后逐漸下降。但AIMV培養基第12d的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明顯高于完全培養基培養組（189.075±6.343）pg/ml，且下降水平也慢于CM組，見(jiàn)圖3。
    A：培養前；B：完全培養基培養后；C：AIMV培養基后表1  ＡＩＭＶ與完全培養基培養細胞不同時(shí)間的表型變化
2.3.2  IFNγ水平
    AIMV與完全培養基培養的CIK細胞均分泌IFNγ，在第4d IFNγ水平開(kāi)始升高，第14～17d分泌量增大，完全培養基培養組第17d達到高峰為（246.854±4.758） pg/ml，而AIMV組14d達到高峰（227.88±3.048）pg/ml，高峰期后均迅速下降，見(jiàn)圖4。
    2.3.3  TNFα水平
    AIMV與完全培養基誘導培養的CIK細胞均分泌TNFα，第4～17dTNFα水平均平穩升高，完全培養基組第17d達到高峰為（247.032±9.117） pg/ml，第21d略有下降為（186.953±3.815）pg/ml，而AIMV組14d達到高峰為（222.53±8.965）pg/ml，之后TNFα水平開(kāi)始下降，見(jiàn)圖5。
   3  討論
    CIK生物免疫治療已作為腫瘤綜合治療中的一種重要手段，能清除惡性腫瘤患者術(shù)后、放化療后微小殘留病灶及調節患者的免疫能力。但現在用于CIK擴增培養的培養基一般為AB血清培養基，但人ＡＢ血清存在安全性低,不宜質(zhì)控等缺點(diǎn),無(wú)血清培養基正得到越來(lái)越廣泛的應用。多數研究表明,無(wú)血清培養基可代替含血清的完全培養基,二者所得培養物的數目和功能相當[24];但也有不同的觀(guān)點(diǎn),認為應用無(wú)血清培養基所得細胞功能受到損害[5,6]。無(wú)血清培養基ＡＩＭＶ是美國Ｇｉｂｃｏ公司專(zhuān)為體外培養淋巴細胞設計的產(chǎn)品,可用于臨床試驗。因為人ＡＢ血清存在個(gè)體差異、質(zhì)量不穩定等諸多的不確定因素,因而我們選擇美國Ｇｉｂｃｏ公司的胎牛血清配制完全培養基作為標準對照,與無(wú)血清培養基ＡＩＭＶ作對比，探討無(wú)血清培養基代替完全培養基的可行性。
    我們從細胞增殖能力、細胞表型分析及體外CIK細胞分泌的細胞因子等幾個(gè)方面進(jìn)行比較。在細胞增殖能力方面，雖然ＡＩＭＶ培養基培養的CIK細胞較完全培養基培養細胞增殖遲緩，完全培養基增殖高峰期在第12天，增殖平臺為第10～12天，而ＡＩＭＶ培養基增殖高峰期在第14天，增殖平臺為第14～17天，但ＡＩＭＶ培養基培養的CIK細胞增殖平臺期較長(cháng)，增殖倍數（678.7倍）較完全培養基（638.4倍）高。這說(shuō)明無(wú)血清培養基支持細胞增殖能力的更為穩定可靠，也提示使用不同的培養基在回輸時(shí)間上應有所區別。在兩種培養基培養單個(gè)核細胞誘導增殖的過(guò)程中，各細胞表型雖在培養過(guò)程中有一定的差異，但在增殖高峰期無(wú)明顯差別。
    CIK細胞具有較強的殺瘤活性，其作用可能與其在增殖過(guò)程中能分泌某些細胞因子有關(guān)，其主要效應細胞為CD3+CD56+細胞，并出現大量增殖，Lopez等[7]發(fā)現CD56+細胞能高表達IFNγ和TNFα，Hoyle等[8]用FACS檢測到CIK細胞能表達IL2、IFNγ及TNFα，這與我們的研究結果:CIK在體外誘導培養過(guò)程中能分泌IL2、IFNγ、TNFα一致。細胞因子在抗腫瘤的網(wǎng)絡(luò )調控機制非常復雜，IL2、IFNγ、TNFα在體內外抗腫瘤的過(guò)程起著(zhù)重要的抗腫瘤及調節機體免疫功能的作用。分泌IL2，從第4天分泌量均穩定升高，都于12天達到高峰，以后逐漸下降。但AIMV培養基第12天的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明顯高于完全培養基組（189.075±6.343）pg/ml，下降水平也慢于CM組；IFNγ水平在第4天均開(kāi)始升高，第14 ～17天分泌量增大，完全培養基組第17天達到高峰為（246.854±4.758） pg/ml，而AIMV組14天達到高峰（227.88±3.048）pg/ml；而TNFα，第4～17天TNFα水平均平穩升高，完全培養基組第17天達到高峰為（247.032±9.117） pg/ml，而AIMV組14天達到高峰為（222.53±8.965）pg/ml�？梢�(jiàn)，無(wú)論是AIMV培養基還是完全培養基其分泌細胞因子的趨勢是一致的，只是分泌IFNγ、TNFα水平AIMV培養基（14天）較全培養基（17天）早，但分泌水平無(wú)明顯差別（P>0.05）。AIMV培養基分泌細胞因子高峰與CIK效應細胞CD3+CD56+細胞增殖高峰一致（14天），因CIK細胞回輸時(shí)間最好應為在CIK細胞增殖高峰及細胞因子分泌高峰時(shí)，這有利于發(fā)揮其最佳療效，從這方面考慮，AIMV培養基優(yōu)于全培養基。
    我們的實(shí)驗表明，無(wú)血清培養基成分明確,來(lái)源穩定,功能可靠,易于質(zhì)控，有利于保障患者治療的安全�？赏耆娲耆囵B基，避免不必要的醫療糾紛，因而在生物治療中有巨大的優(yōu)勢和廣闊的應用前景。

【參考文獻】
  ［1］ Critzapis A D, Dimitroulopoulos D, Paraskevas E, et al. Large scale expansion of CD3+CD56+ lymphocytes capable of lying autologous tumor cells with cytokinerich supernatants\[J\]. Cancer Immunol Immunother,2002,51(8):440448.

［2］Lefebvre P, Winter J N, Kahn L E, et al. Megakaryocyte ex vivo expansion potential of three hematopoietic sources in serum and serumfree medium \[J\]. J Hematother,1999,8（2）:199208.

［3］Bulter M, Burgener A, Patrick M, et al .Application of a serumfree medium for the growth of Vero cells and the production of reovirus\[J\].Biotechnol Prog,2000,16（5）:854858.

［4］Kambe N, Kambe M, Chang HW, et al. An improved proved procedure for the development of human mast cells from dispersed fetal liver cells in serumfree culture medium \[J\]. J Immunol Methods, 2000,240（12）:101110.

［5］Sekhar M, Yu JM, Soma T, et al. Murine longterm repopulating ability is compromised by ex vivo culture in serumfree medium despite preservation of committed progenitors\[J\]. J He matother, 1997,6（6）:543549.

［6］Slunt JB, Taketomi EA, PlattsMills TA, et al. Human Tcell responses to Trichopyton tonsurans: Inhibition using the serum free medium Aim V\[J\]. Clin Exp Allergy, 1997,27（10）:11841192.

［7］Lopez R D, Waller E K, Lu P H,et al.Cd58/LFA3 and IL12 providede by activated monocytes are critical in the in vitro expansion of CD56+ T cells\[J\]. cancer Immunol Immunot,2001,49(12):629640.

［8］Hoyle C, Bangs C D, Chang P, et al. Expansion of Philadelphia chromosomeNegative CD3+CD56+ cytotoxic cells from chronic myeloid leukemia patients :in virto and in vivo efficacy in severe combined immunodeficiency disease mice \[J\].Blood,1998,92(9):33183327.

上一篇：一種改進(jìn)的三糖鐵尿素培養基

下一篇：微生物在不同培養基上生長(cháng)情況的研究

相關(guān)文章:

CFP無(wú)血培養基	無(wú)血清培養基
無(wú)血清技術(shù)及其培養基（二）	無(wú)血清技術(shù)及其培養基（一）
無(wú)血清培養基介紹	幽門(mén)螺桿菌改良無(wú)血培養基的研制