一種改進(jìn)的三糖鐵尿素培養基

【摘要】  將雙糖培養基改進(jìn)為三糖鐵尿素斜面培養基，易于尿素酶陽(yáng)性菌的結果觀(guān)察。方法 在雙糖培養基基礎上再加入2%尿素，0.2% KH2PO4，1%蔗糖制成三糖鐵尿素培養基。結果經(jīng)改進(jìn)后的三糖鐵尿素培養基與相關(guān)的目的菌進(jìn)行性能測定試驗后的反應符合要求。結論 改進(jìn)后的培養基易于尿素酶陽(yáng)性菌的觀(guān)察，可以減少單管試驗。配制方法簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力，尤其適用于基層實(shí)驗室工作。

【關(guān)鍵詞】  雙糖 尿素 培養基

    【Abstract】  Objective   To quickly detect the intestinal bacteria. Methods  The agar media of triple sugar iron (TSI) was made from 2% of urea, 0.2% of KH2PO4 and 1% of sucrose on the double sugar agar and tested for its function by using the related bacteria.Results  The target bacteria were successfully cultured by using TSI agar.Conclusion  The modified culture medium is fit to observe masculine fungi of urease and can reduce the single-valve experiment. The configuration method is easy, timesaving and laborsaving, especially suitable for the basic laboratory.

    【Key words】  Double sugar iron; urea; culture medium

    為了能簡(jiǎn)便快速的鑒定出腸道致病菌，以滿(mǎn)足基層實(shí)驗室的需求，我們根據現有的雙糖鐵瓊脂培養基進(jìn)行改良配制后，選用各不同生化反應的腸桿菌科的目的菌株對改進(jìn)后的培養基進(jìn)行了性能測定，證明效果尚佳，現將方法介紹如下。

    1  材料與方法

    1.1  材料來(lái)源

    1.1.1  基礎培養基  雙糖鐵瓊脂培養基（上、下層），購于杭州微生物試劑廠(chǎng)。三糖鐵瓊脂，購于杭州微生物試劑廠(chǎng)。尿素；KH2PO4均購于西安化學(xué)試劑廠(chǎng)。

    1.1.2  待檢菌株  志賀菌 (1.1869)；由GGMCC提供，沙門(mén)菌（1.1174）；由GGMCC提供，地方株：宋內志賀菌株，菌號：05002；傷寒沙門(mén)菌株，菌號：04010；腸炎沙門(mén)菌株，菌號：05007；大腸埃希菌（ETEC O78:K80，）菌號：05008；普通變形桿菌，菌號：07016；弗勞地枸櫞酸桿菌，菌號：040011，以上菌株均由本室保存。

    1.1.3  診斷血清  志賀菌屬診斷血清（48種）；沙門(mén)菌屬診斷血清（59種）；腸致病性大腸埃希菌診斷血清（15種）以上各屬血清均由衛生部蘭州生物制品研究所提供。腸侵襲性、產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清（16種）由衛生部成都生物制品研究所提供。以上各屬血清均在有效期限內使用。

    1.2  方法

    1.2.1  三糖鐵尿素培養基的配制  配制培養基用華氏小試管應清洗干凈后加塞包裝好，經(jīng)15 Pa 20min高壓滅菌后備用。將成品雙糖鐵瓊脂培養基按說(shuō)明分別稱(chēng)量配制上、下層后混勻，將已配好的上層培養基內加入1%的蔗糖，稍加溫溶解混勻后分裝于適量的小三角燒瓶?jì)雀邏簜溆�。再�?SPAN lang=EN-US>2%尿素、0.2% KH2PO4的量加入已稱(chēng)量配好的下層培養基內，稍加溫后混勻待溫度冷卻后用NaOH校正pH至7.0。將配好的該培養基下層分裝于已高壓滅菌好的華氏小試管中約1.5～2ml直立包裝。再與上層培養基一同經(jīng)10Pa 10min高壓滅菌后置冰箱保存備用。

    試驗前可將配制好的上層培養基溶解后，以無(wú)菌操作下分裝于已配制好并高壓滅菌的下層培養基管中2～2.5ml制成斜面備用。此時(shí)的培養基即為三糖鐵尿素半固體斜面培養基。

    1.2.2  樣品接種   將待檢目的菌進(jìn)行復活后，分別劃種于S.S瓊脂平板上置37℃溫箱培養18～24h，再取配制好的三糖鐵尿素半固體斜面培養基注明菌號后，挑取經(jīng)S.S瓊脂平板上培養后的典型菌落，分別穿刺接種于上述培養基內，置37℃溫箱培養18～24h后觀(guān)察結果，各待檢菌的初步生化反應結果見(jiàn)表1。 表1  不同菌株在三糖鐵尿素斜面上的反應 注：（1） K為紅色；  A為黃色；  ＋為陽(yáng)性；  -為陰性；  +/- 大多時(shí)為陽(yáng)性，少時(shí)為陰性；-/+ 少時(shí)為陰性，大多時(shí)為陽(yáng)性；  (-) 多時(shí)為陰性；   (+) 多時(shí)為陽(yáng)性；  D為不定。

    1.2.3  配制時(shí)應注意點(diǎn)  尿素酶極受溫度影響,高壓時(shí)溫度過(guò)高過(guò)久，都有可能使尿素酶分解，如加熱不足，又可造成滅菌不徹底，所以準確的把握滅菌溫度及加熱時(shí)間是關(guān)鍵。

    加入適量的KH2PO4后，能阻止尿素在滅菌過(guò)程中產(chǎn)生的氨與二氧化碳聯(lián)結為氨基甲酸銨，同時(shí)KH2PO4還可起到緩沖作用，如果溫度掌握適中可使下層培養基pH保持在7.0～7.1，加入KH2PO4后，可發(fā)揮尿素酶的最大活力，易于尿素酶陽(yáng)性菌的結果觀(guān)察。

    我們將改進(jìn)后的培養基經(jīng)過(guò)實(shí)驗后的反應歸納有以下幾種：斜面不變色、底層變黃色，不產(chǎn)氣、無(wú)動(dòng)力，硫化氫陰性，不分解尿素酶者可考慮為志賀菌屬細菌；

    斜面不變色、底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣、產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素酶者可考慮為沙門(mén)菌屬細菌；

    斜面不變色，底層產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，尿素酶陰性、可產(chǎn)生少量硫化氫者可考慮傷寒沙門(mén)菌；

    斜面和底層均變紅色，有動(dòng)力，產(chǎn)或不產(chǎn)氣，硫化氫陽(yáng)性或陰性，尿素酶陽(yáng)性者可考慮為變形桿菌屬細菌。

    根據以上各生化反應，能初步判斷所屬的屬或種，然后再以血清學(xué)試驗加以證實(shí)確定屬或種，同時(shí)還可以從以上生化試驗中判定出無(wú)診斷血清的其它菌屬［1］。

    3  討論

    細菌檢驗需要經(jīng)過(guò)分離、培養、繁殖、動(dòng)態(tài)觀(guān)察以及生化特性的不固定變化等因素綜合判定并認真鑒定后才能拿到確定的菌株，與其他檢驗醫學(xué)方面最大的不同也在于此, 至今仍離不開(kāi)傳統的手工操作。改進(jìn)后的三糖鐵尿素半固體斜面培養基與其他腸桿菌科培養基最大的優(yōu)點(diǎn)是易于觀(guān)察尿素酶的結果，可以不做其他輔助生化。在一支培養基中，同時(shí)觀(guān)察多種生化反應和生長(cháng)情況，可以防止尿素酶陽(yáng)性的細菌漏檢。用于腸道菌檢查用的單糖，雙糖、三糖、四糖等培養基配制方法很多［2］，但由于配制耗時(shí)和基層實(shí)驗室在配制中的諸多問(wèn)題，以致在許多基層實(shí)驗室不能正常使用。市場(chǎng)上出售的雙糖鐵（kligler）和三糖鐵（TS1）瓊脂培養基干粉成品［3］，雖已廣泛用于腸道細菌的檢驗工作，但均不含尿素成份。如果檢驗尿素酶陽(yáng)性的細菌須另做單獨的尿素管，改進(jìn)后的培養基就可以減少繁瑣的單管試驗方法。該培養基的配制方法簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力，不需要任何高端技術(shù)和儀器，適用于各類(lèi)實(shí)驗室，尤其適用于基層腹瀉病門(mén)診實(shí)驗室工作。

    我們推薦使用的該培養基經(jīng)過(guò)同行多年的工作實(shí)踐總結，已在當地推薦并長(cháng)期使用，效果很好。我們相信該培養基在傳統的微生物分離技術(shù)上會(huì )給同行帶來(lái)方便，我們愿與同行共享。

【參考文獻】
  1 P. R愛(ài)德華，W．H． 愛(ài)文. 腸桿菌科的鑒定.衛生部藥品生物制品檢定所.江西省衛生防疫站，第3版，1997：92.

2 陳夫元，劉捷.細菌培養基. 北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社， 1992,149-156.

3 扳琦利一．他． 新細菌培地講座（第二版）下1. 東京:近代出版社，1993,180.

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