論文摘要:采用正交實(shí)驗設計,對一種富集光合細菌的培養基進(jìn)行優(yōu)化,試驗結果表明:酵母膏和NaHCO3在培養基中的濃度對富集紅螺菌科的光合細菌有顯著(zhù)的影響。若以達到相同生長(cháng)量(OD660值)做指標,應用優(yōu)選出來(lái)的培養基進(jìn)行富集比原培養基要提前5~6 d。
光合細菌(PSB)是一大類(lèi)能進(jìn)行光合作用的原核生物的總稱(chēng)。研究應用的實(shí)踐表明,光合細菌中的紅螺菌科能利用多種硫化物和有機物作為其光合作用的供氫體和有機碳源,在高濃度的有機廢水處理與資源化、水產(chǎn)養殖的水質(zhì)調控與促進(jìn)健康生長(cháng)、在農業(yè)中作為高效活性菌肥等方面,發(fā)揮著(zhù)十分有益的和令人矚目的作用[1]。光合細菌的推廣和應用,需要合適的培養基質(zhì),但目前經(jīng)典的用于富集紅螺菌科光合細菌的培養基(小林達治1977)[2]平均富集的時(shí)間為2~8周,且存在培養基成分種類(lèi)多,成本較高的缺點(diǎn)。為此,筆者在教學(xué)實(shí)踐中,對其進(jìn)行應用型優(yōu)化設計,旨在為高活性光合細菌的推廣應用提供一定的幫助。
1 材料和方法
1.1 樣品和菌種來(lái)源
光合細菌樣品來(lái)自湛江港岸潮間帶表層沉積物、湛江湖光巖附近奶牛養殖場(chǎng)和鴨塘的污水和底泥中。共分離出3種紅螺菌科菌株:沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、莢膜紅假單胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、紅螺菌(Rhodospirillumsp.),沼澤紅假單胞菌為優(yōu)勢菌群,故選沼澤紅假單胞菌為本試驗菌種。
1.2 培養基
富集培養基采用《微生物學(xué)實(shí)驗教程》[2]中配方:氯化銨0.1 g,碳酸氫鈉0.1 g(5%水溶液,過(guò)濾除菌取2 ml加入),磷酸氫二鉀0.02 g,乙酸鈉0.1~0.5 g(取0.3 g),七水硫酸鎂0.02 g,氯化鈉0.05~0.2 g,(取0.2 g)生長(cháng)因子1ml,微量元素溶液1ml,蒸餾水97 ml,pH 7.0。
1.3 方法
1.3.1 富集培養基的初步優(yōu)選
1.3.1.1 NaHCO3利用試驗 在試驗過(guò)程中發(fā)現:適當的提高NaHCO3濃度,可縮短富集的時(shí)間。為探索其中量的關(guān)系,筆者做如下試驗設計:取滅菌的富集培養基以250 ml/瓶裝入醫用點(diǎn)滴瓶中,上鋪一層無(wú)菌液體石蠟, NaHCO3過(guò)濾除菌后依比例0.1%,0.15%,0.2%,0.25%,0.3%加入。每種培養條件做2個(gè)重復。沼澤紅假單胞菌(7.4×108個(gè)/ml)接種量為2%, 30℃,3000 lx光照強度下連續培養6d,每天在660 nm處測定其光密度OD值,以不加碳酸氫鈉的培養基接種做對照。
1.3.1.2 酵母膏對光合細菌生長(cháng)的影響 紅螺菌科光合細菌生長(cháng)需要硫胺素、生物素等生長(cháng)因子。為此,在培養基中添加一定量的酵母膏能促進(jìn)光合細菌生長(cháng)。將富集培養基中的生長(cháng)因子和微量元素溶液分別用蒸餾水替代,酵母膏分別以0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%,0.25%添加。同1.3.1.1接種培養3 d后,測定其OD660值。
1.3.2 改良培養基組成成分的正交試驗設計[3]為研究NaHCO3和酵母膏濃度對富集培養基的綜合效應及和作為氮源的NH4Cl有無(wú)交互作用,采用L8(27)正交試驗設計(如表1),富集培養基100 ml,去除其中的生長(cháng)因子和微量元素溶液
1.3.3 優(yōu)化培養基的確立分別從湛江港岸潮間帶表層、湛江湖光巖附近奶牛養殖場(chǎng)及鴨塘取淤泥、污水若干。50 g淤泥及100 ml污水裝入500 ml具塞磨砂廣口瓶,每個(gè)樣品4瓶。2瓶添加200 ml改良的富集培養基,另外2瓶添加原富集培養基。攪拌均勻后,加入滅菌的液體石蠟以隔絕空氣。25~35℃下用5000~10000 lx(距40 W白熾燈15~50 cm)的光照強度連續培養18 d,觀(guān)察記錄兩種富集培養基富集培養過(guò)程中光密度(OD660)變化。
2 結果與分析
2.1 富集培養基的初步優(yōu)選結果
2.1.1 NaHCO3利用試驗
隨著(zhù)NaHCO3濃度的增加,菌株到達穩定生長(cháng)期的時(shí)間縮短。NaHCO3濃度<2%時(shí),菌體生長(cháng)濃度隨NaHCO3濃度增加而增大。2%時(shí),光密度值最大。說(shuō)明此時(shí)光合細菌的生長(cháng)條件最為適合(見(jiàn)圖1)。
2.1.2 酵母膏利用試驗
隨著(zhù)酵母膏濃度的增加,光合細菌菌體生長(cháng)濃度逐漸增大。當培養基中酵母膏的濃度為0.1%時(shí),其菌體生長(cháng)濃度和添加0.15%酵母膏時(shí)的生長(cháng)濃度無(wú)顯著(zhù)性差異,從經(jīng)濟角度考慮,選擇0.1%酵母膏較好(見(jiàn)圖2)。
2.2 正交實(shí)驗結果
從方差分析表結果可以看出:A因素(NaHCO3)和C因素(酵母膏)的主效應是主要影響因素。酵母膏的含量對富集試驗結果的影響要更大一些。NaHCO3作為添加的碳源,和作為氮源的酵母膏、NH4Cl之間的交互作用都很小。培養基合適的C/N是微生物進(jìn)行正常生長(cháng)繁殖的前提,從極差分析很容易選出最優(yōu)水平是A2B1C2,即改良培養基的NaHCO3含量為2.0 g,酵母膏含量為1.0 g,其他條件不變。從以上分析得出優(yōu)選培養基:氯化銨0.1 g,碳酸氫鈉0.2 g(5%水溶液,過(guò)濾除菌取4 ml加入),磷酸氫二鉀0.02 g,乙酸鈉0.1~0.5g(取0.3 g),七水硫酸鎂0.02 g,氯化鈉0.05~0.2 g(取0.2 g),酵母膏0.1 g,蒸餾水96 ml,pH 7.0。
2.3 優(yōu)化培養基的驗證結果
兩種富集培養基富集培養結果見(jiàn)圖3~圖5。由圖可見(jiàn):海灘污水樣品中光合細菌使用改良富集培養基12 d培養液轉紅色(OD660=0.321),而原富集培養基富集培養液轉紅色(OD660=0.329)在第18 d出現;鴨塘污水中光合細菌使用改良培養基富集11 d培養液轉紅色(OD660=0.326),而原富集培養基富集培養液轉紅色(OD660=0.329)則在第16 d出現;奶牛場(chǎng)污水中光合細菌使用改良培養基富集11d培養液轉紅色(OD660=0.339),而原富集培養基培養液轉紅色(OD660=0.339)則在第16 d出現。使用改良培養基從3個(gè)地點(diǎn)(海灘、奶牛場(chǎng)、鴨塘)樣品中富集光合細菌比原培養基提前5~6 d。
3 討論
NaHCO3在富集光合細菌過(guò)程中有很大的作用。①用于調整培養液的pH。對于異養型光合細菌,一般使用5%的NaHCO3把pH調節到7.0~8.0。②NaHCO3產(chǎn)生的CO2在細菌營(yíng)養代謝中具有重要作用。首先,CO2能與有機酸結合,生成多羧基酸,在三羧酸循環(huán)中起重要作用[4]。其次,CO2能促進(jìn)莢膜細菌莢膜的形成,推測其可促進(jìn)莢膜紅假單胞菌的增殖[5]。③富集培養相對于分離培養所用的時(shí)間較長(cháng),加大作為碳源的碳酸氫鈉的用量能延續增長(cháng)光合細菌的數量,這點(diǎn)對于第一次富集培養尤為重要;但是NaHCO3不能加得過(guò)多,這是因為NaHCO3會(huì )導致培養液堿化而不利于光合細菌的生長(cháng);NaHCO3是富集螺旋藻等其他藻類(lèi)的主要營(yíng)養成分。加量過(guò)多,促進(jìn)藻類(lèi)繁殖,光合細菌富集會(huì )受到影響。
酵母膏對光合細菌的生長(cháng)有明顯的刺激作用。這主要是由于酵母膏的營(yíng)養豐富,含有光合細菌所需要的各種生長(cháng)因子。酵母膏濃度在0.25%以?xún)葘w繁殖速度有很大的影響,但濃度過(guò)高,容易染菌,不利于分離[6]。
光合細菌是國內外致力于開(kāi)發(fā)的微生物資源,在水產(chǎn)養殖業(yè)中具有去除NH4+和NO2-,改善水質(zhì),提高魚(yú)飼料營(yíng)養,促進(jìn)魚(yú)、蝦生長(cháng)發(fā)育的功效。光合細菌的推廣應用需要合適的培養基質(zhì),本試驗根據細菌的生長(cháng)速度和產(chǎn)量來(lái)看,改良培養基效果良好。但能否是最佳方案,還需進(jìn)一步研究。
參考文獻:
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