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【摘要】 從高活性菌株到獲得高產(chǎn)量活性產(chǎn)物之間，發(fā)酵是一個(gè)重要環(huán)節。本研究設計4種內生菌發(fā)酵培養基，對89株分離自傣藥植物且具有高抗菌活性的內生菌及5株潛在放線(xiàn)菌新種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液的提取物用3種展層系統作薄層色譜(TLC)展層，用UV(254nm、366nm)和茴香醛試劑進(jìn)行檢測。實(shí)驗結果表明，用1號和4號培養基發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的種類(lèi)最豐富，2號和3號培養基產(chǎn)生的較少；用II號展層系統(氯仿∶甲醇=4∶1)和III號展層系統(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)作TLC層析，檢測到的產(chǎn)物最多；3種檢測方法以茴香醛檢測到的代謝產(chǎn)物最豐富。對每一株菌而言，產(chǎn)生最多產(chǎn)物的發(fā)酵培養基各不相同，為了獲得盡可能多的次生代謝產(chǎn)物，不同菌株選用的發(fā)酵培養基不一樣。探究適合的發(fā)酵培養條件，為活性產(chǎn)物的分離、制備奠定了基礎。
【關(guān)鍵詞】 植物內生菌； 發(fā)酵培養基； TLC
ABSTRACT Fermentation of 89 endophytes and 5 novel species candidates of actinomycetes were carried out by four different fermentation media. Three developing systems were used for chromatography of TLC. UV 254nm, 366nm and anisaldehyde as a chromogenic agent were used for detecting compounds of these strains. Results indicate that the metabolites of these strains were the most abundant when these strains were fermented in No.1 and No.4 media, and only few in No.2 and No.3. Metabolites of each strain were different in different media. More metabolites could be detected when the TLC was carried out in system II (chloroform∶methanol=9∶1) and system III (butanol∶acetic acid∶water=4∶1∶5) with anisaldehyde test solution. These result established a base for designing of fermentation medium, isolation and purification of effective compounds for discovery of new leader compounds from endophytes.
KEY WORDS Plant endophytes; Fermentation medium; TLC
至今已描述的放線(xiàn)菌達40個(gè)科、180多屬、4000多種［1］，從中發(fā)現的生物活性物質(zhì)達11000種之多［2］，目前臨床和農牧業(yè)上應用的抗生素有60%以上是放線(xiàn)菌生產(chǎn)的。當今要從普通環(huán)境微生物發(fā)現新的生物活性物質(zhì)越來(lái)越困難，其中去重復就是一道難題［3］。但是，自然界仍然存在至少90%以上的未知微生物［2，4～6］，其中植物內生菌越來(lái)越受人們的重視［7］。為了充分利用云南豐富的植物內生菌資源，從中發(fā)現更多的新活性物質(zhì)，近3年我們從云南西雙版納采集50科、96屬的傣藥植物樣品123份，分離到內生菌1673株，用7種作物病原菌、4種腫瘤細胞模型，篩選到抗菌、抗腫瘤高活性菌株230株。從高活性菌株到獲得高產(chǎn)量活性產(chǎn)物之間，發(fā)酵是一個(gè)重要環(huán)節。本文對89株植物內生菌和5株放線(xiàn)菌潛在新種的發(fā)酵培養基進(jìn)行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 菌種
從云南西雙版納傣藥植物分離篩選到89株抗腫瘤、抗作物病原菌的高活性?xún)壬�，其�?SPAN lang=EN-US>50株放線(xiàn)菌、10株真菌、29株細菌；另外有5株具有抗菌活性的放線(xiàn)菌潛在新種，共94個(gè)菌株。
1.2 斜面培養基
真菌 PDA固體培養基［8］。
細菌和放線(xiàn)菌 酵母膏
復合維生素 維生素B1 1mg，維生素B6 1mg，核黃素1mg，煙酸1mg，苯丙氨酸1mg，維生素H 1mg，丙胺酸0.3mg［10］。
微量鹽 FeSO4·7H2O
1.3 發(fā)酵培養基
1號培養基 黃豆粉
2號培養基 可溶性淀粉
3號培養基 葡萄糖
4號培養基 大豆粉
將菌種接種于斜面培養基，
1.4 發(fā)酵樣品提取物制備
發(fā)酵液加入等體積95%乙醇，
1.5 TLC分析
用毛細管點(diǎn)樣于硅膠GF254薄層板上，用三種展層體系和三種檢測條件進(jìn)行分析。
1.6 三種展層體系
I：氯仿∶甲醇(9∶1)；
II：氯仿∶甲醇(4∶1)；
III：正丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶5，用上層)。
1.7 三種檢測條件
選取常用的254nm熒光淬滅成像檢測、366nm熒光成像檢測和具有廣譜性的茴香醛硫酸溶液顯色檢測。茴香醛硫酸溶液(母液)：乙醇∶冰乙酸∶濃硫酸(85∶10∶5)；100ml母液加入1ml茴香醛。
1.8 HPLC分析
甲醇溶解的樣品用0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾，10μl進(jìn)樣于HPLC儀。色譜柱為Zorbax Eclipse XDBC18(
1.9 儀器與試劑
真空冷凍干燥機為英國Edwards公司產(chǎn)品；薄層數碼成像儀為瑞士CAMAG公司Repostar 3型產(chǎn)品；高效液相色譜儀為美國Agilent 1100系列；薄層硅膠GF254板為青島海洋化工廠(chǎng)生產(chǎn)。所用試劑均為分析純。
2 結果及討論
由于實(shí)驗菌株發(fā)酵后所產(chǎn)生的有效成分尚不清楚，因此從菌株生長(cháng)情況和產(chǎn)生的化合物條帶的多少初步評判發(fā)酵培養基的好壞。
2.1 菌株生長(cháng)情況
94株菌在4種發(fā)酵培養基中均能生長(cháng)，在1號和4號培養基中的生長(cháng)比在2號和3號培養基中生長(cháng)得好。
2.2 TLC檢測結果
94株菌的4種發(fā)酵液提取物，采用標準化程序：三種展層體系展層和三種檢測條件的TLC分析，薄層掃描儀掃描、儲存(統計結果見(jiàn)Fig.1和Tab.1)、檢索比較后，將存在未知化合物的產(chǎn)生菌作為進(jìn)一步實(shí)驗的材料。
后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶數目明顯多于2號和3號；4號培養基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶總數又多于1號培養基，3號培養基所檢測到的數目最少。例如，94個(gè)菌株用4號培養基發(fā)酵提取物，用氯仿∶甲醇(4∶1)展層，254nm、366nm、茴香醛檢測的結果，分別共有387、346、394個(gè)條帶，1號培養基分別有297、303、300個(gè)條帶，而3號培養基僅有81、142、198個(gè)條帶。
在相同的展開(kāi)體系和檢測條件下比較Rf值，結果顯示，相同菌株在不同的培養基中產(chǎn)生不完全相同的條帶，盡管4號培養基產(chǎn)生的化合物條帶最多，但其它培養基也能產(chǎn)生一些4號培養基不能產(chǎn)生的化合物。也就是說(shuō)，同一個(gè)菌株在不同培養基的發(fā)酵產(chǎn)物是不一樣的。
通過(guò)不同菌株4種培養基發(fā)酵產(chǎn)物的TLC結果比較，94株菌中有49株在1號培養基中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶最多，42株在4號培養基中最好，另外3株為2號培養基。本實(shí)驗的放線(xiàn)菌(包括5個(gè)潛在新種)、真菌、細菌用4種培養基發(fā)酵的結果同樣是1、4號培養基的條帶多于2、3號(Tab.2)，但每一株菌產(chǎn)生最多產(chǎn)物的培養基各不相同。所以，為了獲得盡可能多的代謝產(chǎn)物，不同菌株的發(fā)酵培養基應有所不同。
Tab.3是用1、4培養基發(fā)酵，產(chǎn)生產(chǎn)物較多的10株菌的檢測結果�？梢钥闯�，1號培養基有3株的條帶在10條以上，4號培養基只有1株產(chǎn)生8個(gè)條帶，1株7個(gè)條帶，3株6個(gè)條帶。
2.3 不同展層系統、不同檢測條件的效果
3種展層系統的極性從小到大。Tab.1和Fig.1的結果表明，各個(gè)展層系統的展層效果明顯不同。II系統(氯仿∶甲醇=4∶1)在三個(gè)系統中屬中等極性，檢測到的條帶最多，總條帶有3039個(gè)；I系統(氯仿∶甲醇=9∶1)有2708個(gè)，III系統(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)只有2616個(gè)。不同的檢測條件檢測到的結果
2.4 HPLC檢測結果
選取部分菌株樣品進(jìn)行HPLC檢測，結果顯示，不同菌株產(chǎn)生的次生物質(zhì)存在明顯差異，相同菌株在不同培養基中也存在一定的差異。在254nm波長(cháng)的檢測條件下，用1號培養基發(fā)酵后產(chǎn)生的產(chǎn)物比其它培養基發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物多，結果與TLC檢測結果相對應。Fig.2為具有高抗菌活性的植物內生放線(xiàn)菌菌株YIM 48790(Dactylosporangium屬的潛在新種)和YIM 56167采用1號培養基發(fā)酵后的次生代謝產(chǎn)物。圖中明顯看出，兩株放線(xiàn)菌通過(guò)1號培養基發(fā)酵后產(chǎn)生了大量次生代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的組成也大不一樣。
3 討論
89株植物內生菌、5株放線(xiàn)菌潛在新種采用4種培養基進(jìn)行發(fā)酵，三種檢測方法檢測，所獲得的結果表明，不同培養基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不相同。52%(49株)的菌株用1號培養基發(fā)酵，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶總數最多；44%的菌株用4號培養基發(fā)酵條帶最多。但每一株菌產(chǎn)生最多產(chǎn)物的培養基各不相同。同一個(gè)菌株在不同培養基發(fā)酵的產(chǎn)物種類(lèi)也不一樣，1號培養基成分最單一，便于化合物的提取、純化，且成本低廉；4號培養基成分比較復雜，不利于以后化合物的分離純化。所以1號培養基是一種比較理想的發(fā)酵培養基，可
Fig.2 HPLC chromatography of 2 actinomycete
strains at 254nm以在篩選時(shí)用于大量菌株的發(fā)酵。三種檢測條件中，茴香醛檢測法獲得的總條帶最多，也可供選用。這些結果為設計適合的發(fā)酵培養條件、檢測方法以及活性產(chǎn)物的分離、制備奠定了基礎。
在微生物生物活性物質(zhì)研究中，無(wú)論TLC檢測還是HPLC檢測，和其它現代儀器的檢測都是可行的途徑，但特別要注意實(shí)驗條件的標準化，確保數據的準確性，同時(shí)要建立相應的數據庫，使數據儲存、檢索、查尋、分析程序化。
發(fā)現新的先導化合物是開(kāi)發(fā)天然藥物的重要關(guān)鍵之一［11］，高活性菌株、新菌種提供了發(fā)現新產(chǎn)物的可能性。要實(shí)現這種可能性，發(fā)酵是重要環(huán)節。過(guò)去對植物內生菌、極端環(huán)境微生物、海洋微生物培養條件的研究不多，但這些微生物是很有開(kāi)發(fā)潛力的資源，應該重視這方面的研究，為發(fā)現新先導化合物提供技術(shù)支持
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