【摘要】 目的建立金線(xiàn)蓮快繁體系。方法以莖段為外植體，開(kāi)展了莖段不同部位、培養基、激素、有機物和活性炭對不定芽增殖、幼苗生長(cháng)的影響研究，并進(jìn)行了移栽試驗。結果外植體以不含頂芽和長(cháng)根的中間段莖節為好；不定芽增殖最佳培養基配方為MS（或B5）+BA3.0 mg/L +NAA0.5～1.0 mg/L，兩個(gè)月增殖倍數達5.0以上；壯苗最適培養基為1/2MS＋NAA3.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子汁20%）；試管苗移栽適宜的基質(zhì)為菜園土1份＋2～3 mm粗砂2份（或1份）＋木屑1份（或2份），3個(gè)月成活率均達100%，且生長(cháng)良好。結論采用上述方法，能實(shí)現金線(xiàn)蓮幼苗的快速繁殖�！�
【關(guān)鍵詞】 金線(xiàn)蓮； 快速繁殖； 增殖； 生長(cháng)； 移栽
金線(xiàn)蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl為蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生草本，別名金蠶、金線(xiàn)蘭、金線(xiàn)虎頭蕉等，是我國傳統珍貴藥材，素有“金草”“神藥”“烏人參”等美稱(chēng)，在民間應用范圍較廣，廣泛應用于風(fēng)濕性關(guān)節炎、高血壓病、糖尿病、腎病等疑難雜癥的治療和強身健體、病后體虛恢復等方面，在浙江、福建、臺灣等省和東南亞地區被視為珍稀名貴藥材，特別在臺灣省更是備受青睞，被稱(chēng)為“藥中之王”［1，2］。
金線(xiàn)蓮種子微小，由未成熟的胚及數層種皮細胞構成，自然萌發(fā)率和繁殖率低，目前市場(chǎng)上貨源主要來(lái)自于野生采挖，產(chǎn)品一直處于供不應求的狀況。近年來(lái)，隨著(zhù)對其藥效學(xué)和臨床應用研究的深入，對金線(xiàn)蓮藥用價(jià)值的認識進(jìn)一步提高，其市場(chǎng)貨源緊缺的狀況更為嚴峻，野生資源也不斷遭到破壞性采挖，以致于處于瀕臨滅絕之地。本研究旨在采用組織培養技術(shù)，解決金線(xiàn)蓮種苗來(lái)源，加快人工栽培，以保護金線(xiàn)蓮野生資源、穩定市場(chǎng)供應�，F將有關(guān)實(shí)驗結果如下。
1 材料與方法
1.1 材料 無(wú)菌繁殖體系的建立為浙江金線(xiàn)蓮野生種源，其它實(shí)驗為繼代培養的不定芽及無(wú)根幼苗莖段。
1.2 無(wú)菌繁殖體系的建立 取生長(cháng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，去葉后放入低濃度的洗衣粉水中漂洗3～5 min，然后用流水沖洗30 min。在超靜工作臺前，用75% 酒精濕潤5～6 s，放入0.1%的HgCl溶液滅菌12～13 min，用無(wú)菌水沖洗5～6次。將消毒好的莖按上段（具莖尖）、中段和下段（匍匐莖段）切成長(cháng)約1.5～2 cm，帶有1～2個(gè)節間的小段，分別接種于MS+6－BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培養基上，pH5.6，蔗糖2.5%，瓊脂0.7%。培養條件為：溫度(25±2）℃ ，光照時(shí)間12 h/d，光照強度1 500～2 000 lx。
1.3 不定芽誘導
1.3.1 基本培養基對不定芽誘導的影響 采用單因素實(shí)驗，培養基選用MS（Murashige-Skoog）［3］，1/2MS（大量元素減半，其他成分不變），VW(Vacin & Went)，B5（Gamborg•Miller & Ojima）和KC(Knudson C)等5種，分別添加6－BA 4.0mg/L，NAA 1.0 mg/L。
1.3.2 激素對不定芽誘導的影響 以MS為基本培養基，添加不同種類(lèi)及濃度的細胞分裂素和生長(cháng)素。
上述實(shí)驗選取無(wú)菌健壯植株，切取長(cháng)約1～1.5 cm，帶有一個(gè)節間的莖中段，每處理接10個(gè)莖節，重復3次。培養期間定時(shí)觀(guān)察不定芽生長(cháng)情況，培養60 d后統計不定芽數。其它條件同實(shí)驗“1.2”項。
1.4 壯苗培養
1.4.1 激素對幼苗生長(cháng)和發(fā)根的影響 以1/2MS為基本培養基，NAA設1～5 mg/L 5個(gè)處理，6－BA設0.5，1.0和1.5 mg/L 3個(gè)處理，共15個(gè)處理。
1.4.2 添加物對幼苗生長(cháng)和發(fā)根的影響以1/2MS＋NAA 2.0 mg/L＋6－BA 0.5 mg/L為基本培養，考察馬鈴薯提取物、香蕉提取物、蘋(píng)果提取物、椰子汁等4種天然有機物和活性炭對金線(xiàn)蓮幼苗生長(cháng)的影響。
上述每種培養基均接入經(jīng)增殖培養高約3 cm，具3～4節間、有1～2片的無(wú)根幼苗，每處理接種接無(wú)根幼苗10株，重復3次。培養后每隔15 d觀(guān)察生長(cháng)情況1次，至3個(gè)月考察每株凈增加的葉片數、重量及發(fā)根數，并進(jìn)行數理統計分析。
1.5 移栽 選苗高約6～8 cm，莖基直徑約2 mm，叢生根有2～3條的試管苗，煉苗4 d后，洗凈附著(zhù)在植株上的培養基，并晾干洗滌水后移人直徑為15 cm，裝有不同基質(zhì)的土盆中，考察不同基質(zhì)對金線(xiàn)蓮試管苗成活率的影響。移栽前，實(shí)驗基質(zhì)均用45%多菌靈可濕性粉劑800倍溶液澆透消毒。實(shí)驗條件為遮蔭度80%的蔭棚，保持空氣相對濕度的80%～90%。如發(fā)現有病死植株，及時(shí)拔除。每處理5盆，每盆種5株，重復3次，移栽3個(gè)月后考察成活株數，并進(jìn)行數理統計分析。
2 結果
2.1 無(wú)菌繁殖體系的建立 實(shí)驗表明，外植體莖段的分化程度對誘導結果存在一定的影響。從表1可知，上、中段莖均能萌動(dòng)生長(cháng)。上段莖因有頂芽的存在，頂端優(yōu)勢表現較為強烈，因而以生長(cháng)為主，不定芽發(fā)生較少，平均芽增殖數為0.6個(gè)；中段莖不定芽發(fā)生快、量大、長(cháng)勢好，平均芽增殖數為4.05個(gè)，并形成多枝叢生狀。下段莖由于組織相對老化，雖有不定芽發(fā)生，但發(fā)生量與生長(cháng)勢均較弱。這和陳自力［4］報道的結果一致。
從實(shí)驗中觀(guān)察到，不定芽的產(chǎn)生以側芽萌生為主。一般在培養15～20 d后，莖節上潛伏的葉腋芽萌動(dòng)膨大，芽叢在節的四周萌出，起初為白色略帶黃色，隨著(zhù)培養時(shí)間加長(cháng)，芽不斷伸展，逐漸轉為黃綠色，形成主芽。葉腋芽是單生的，極個(gè)別節上能對生兩個(gè)腋芽，未發(fā)現莖部或切口處長(cháng)出不定芽。培養30 d左右，主芽基部的節再生側芽(稱(chēng)一級側芽)，45 d左右一級側芽節上又可發(fā)生二級側芽，隨著(zhù)芽的生長(cháng)、出現葉片，節處毛并產(chǎn)生根，外被濃密的白色絨毛，從而形成完整小植株。培養3個(gè)月后每天觀(guān)察，側芽分生組織的增殖，一般只出現主芽和一二級側芽或苗；培養5個(gè)月以上，主芽、側芽較高，葉片較多、大，只有少數出現三級側芽或苗。這種腋芽萌生的增殖形成了主軸分枝型的芽苗，隨培養時(shí)間或繼代繁殖代數的增加，或激素的作用，芽或苗因節間短，多數為形成似不定芽或叢生苗。培養過(guò)程中，未見(jiàn)愈傷組織，也沒(méi)有發(fā)現有原球莖和類(lèi)原球莖產(chǎn)生。
表1 金線(xiàn)蓮莖段外植體不定芽誘導（略）
2.2 不定芽誘導
2.2.1 基本培養基對不定芽誘導的影響 以金線(xiàn)蓮的莖節段作為外植體，腋芽能快速萌發(fā)出不定芽體。經(jīng)60 d的培養，增殖倍數可達3.1～5.4倍。但基本培養基對不定芽的誘導具有明顯的影響，MS，B5培養基不定芽增殖率分別為5.4倍與5.2倍，比其它培養基增加23.8%～74.2%。
表2 基本培養基對金線(xiàn)蓮不定芽誘導的影響（略）
經(jīng)LSR差異顯著(zhù)性測定，MS，B5培養基之間無(wú)明顯差異，與1/2MS，KC和VW之間存在極顯著(zhù)差異，且MS，B5培養基上誘導產(chǎn)生的不定芽色綠、粗壯（見(jiàn)表2），表明MS，B5培養基適合作為金線(xiàn)蓮莖段不定芽誘導的基本培養基［5］。
2.2.2 激素對不定芽誘導的影響 激素種類(lèi)、水平與配比對組織培養快速繁殖在效率存在明顯的影響，6-BA、KT和NAA是3種常用生長(cháng)調節劑，其添加量對金線(xiàn)蓮不定芽增殖的影響很大。結果見(jiàn)表3。從表3可知，同為細胞分裂素的6-BA，KT在相同的添加量下對不定芽的增殖效果差異極顯著(zhù)，6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%，表明6-BA比KT更適合金線(xiàn)蓮莖節不定芽的誘導。
6-BA的濃度也影響不定芽誘導效果。在添加量小于4.0 mg/L的情況下，隨濃度的提高，不定芽增殖率明顯上升，添加量為4.0 mg/L的不定芽增殖率比2.0，1.0 mg/L分別提高22.1%和47.6%。當6-BA添加量達到6.0 mg/L時(shí)，其增殖率還出現下降趨勢，表明本實(shí)驗條件下6-BA添加的適宜量為4.0 mg/L。
表3 激素對金線(xiàn)蓮不定芽誘導的影響（略）
生長(cháng)素NAA對金線(xiàn)蓮不定芽的誘導與生長(cháng)具有明顯的促進(jìn)作用。從表3可以看出，添加了NAA的培養基不定芽增殖量與生長(cháng)明顯較不添加的好，芽體粗壯、色濃綠，其中添加0.5 mg/L的表現最好，添加1.0 mg/L的其次，但二者間差異未達到顯著(zhù)水平；與其它不添加NAA的相比差異達極顯著(zhù)水平。表明在本試驗條件下NAA適宜添加的量為0.5～1.0 mg/L。
2.3 壯苗培養
2.3.1 激素對幼苗生長(cháng)的影響 在金線(xiàn)蓮壯苗培養中，NAA較6-BA對促進(jìn)幼苗生長(cháng)的影響更為明顯。結果見(jiàn)表4。NAA濃度低于3 mg/L時(shí)，對幼苗生長(cháng)有促進(jìn)作用，隨濃度的增加，葉片凈增量、發(fā)根數和鮮重凈增量明顯增加，當濃度達到4.0 mg/L時(shí)，葉片凈增量、發(fā)根數和鮮重凈增量增加不明顯。6-BA在0.5 mg/L情況下，比不加的具有一定的促進(jìn)作用，但未達顯著(zhù)水平；在濃度為1.0 mg/L，1.5 mg/L情況下，葉片凈增量、發(fā)根數和鮮重凈增量反而減少，但在幼苗基部觀(guān)察到叢生狀不定芽的產(chǎn)生，表明6-BA在濃度高于1.0 mg/L情況下，有利于金線(xiàn)蓮不定芽的生成，對幼苗生長(cháng)不利。
從表4也可以看出，處理9、10號在發(fā)根數、鮮生凈增量方面較其它處理明顯提高，達極顯著(zhù)差異；在葉片凈增量方面，除與處理13、14號無(wú)明顯差異外，與其它處理之間的差異達極顯著(zhù)水平，表明在金線(xiàn)蓮壯苗培養中，NAA適宜添加的量為3.0～4.0 mg/L，6-BA 添加量為0.5 mg/L或不加。
表4 激素對金線(xiàn)蓮幼苗生長(cháng)的影響（略）
2.3.2 活性炭與有機添加物對幼苗生長(cháng)的影響 結果見(jiàn)表5。從表5可知，不同的添加物對金線(xiàn)蓮幼苗生長(cháng)的影響表現不一，香蕉、椰子汁對促進(jìn)幼苗生長(cháng)最為有利，葉片凈增量、發(fā)根數和鮮重凈增量均高于其它處理，二者間無(wú)明顯差異；馬鈴薯對幼苗生長(cháng)不利，與其它處理相比均存在極顯著(zhù)差異水平�；钚蕴繉鹁�(xiàn)蓮幼苗生長(cháng)具有一定的促進(jìn)作用，在添加0.3%情況下，葉片凈增量、發(fā)根數和鮮重凈增量與對照相比均顯著(zhù)提高，差異達極顯著(zhù)水平；但與香蕉、椰子汁處理相比，其促進(jìn)幼苗生長(cháng)的作用不如前二者，除發(fā)根數無(wú)差異外，葉凈增量與香蕉、椰子汁處理差異達顯著(zhù)水平，鮮重凈增量差異達極顯著(zhù)水平。同時(shí)觀(guān)察到活性炭、香蕉和椰子汁新發(fā)根潔白、粗壯。試驗結果表明添加20%香蕉和椰子汁最適宜金線(xiàn)蓮幼苗的生長(cháng)。
表5 添加物對金線(xiàn)蓮幼苗生長(cháng)的影響（略）
2.4 移栽 金線(xiàn)蓮試管苗移栽3個(gè)月后的植株成活情況見(jiàn)表6。從表6中可以看出，處理7和處理9保持100%的成活率，處理3和處理8的植株成活率也在93%以上，處理1的成活率最低，僅為56%。經(jīng)LSR差異顯著(zhù)性測定，處理3、7、8、9號之間無(wú)明顯差異，與處理5、6號差異達顯著(zhù)水平、與處理1、2、4號差異達極顯著(zhù)水平。表明在菜園土中加入粗砂、木屑能明顯提高金線(xiàn)蓮試管苗移栽的成活率，適宜添加的比例為1份菜園土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份，要求充分混勻。
表6 種植基質(zhì)對金線(xiàn)蓮試管苗移栽成活率的影響（略）
3 小結
金線(xiàn)蓮不同部位的莖間對不定芽的誘導結果存在明顯的差異，以不含頂芽和長(cháng)根的中間段莖節為好，不定芽增殖率達4倍以上。
采用金線(xiàn)蓮中間莖節作外植體誘導不定芽萌發(fā)時(shí)，適宜的培養基為MS或B5＋6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L～1.0 mg/L，蔗糖濃度為2.5%。
適宜的壯苗培養基為1/2MS＋NAA 3.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子汁20%），蔗糖濃度為3.0%。3.4 試管苗在充分混勻的1份菜園土＋2份粗砂（2～3 mm）＋1份木屑，或1份菜園土＋粗砂1份＋木屑2份的基質(zhì)中生長(cháng)良好，3個(gè)月后成活率達100%。
【參考文獻】
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