公共場(chǎng)所茶具微生物檢驗方法大腸菌群測定

中華人民共和國國家標準

公共場(chǎng)所茶具微生物檢驗方法大 腸 菌 群 測 定GB/T 18204.3-2000

Methods of microbiological examination for tea set in public places

- D et er m in at ion o f C ol ifo rm bacteria

1范圍

本標準規定了公共場(chǎng)所茶具大腸菌群的測定方法。

本標準適用于公共場(chǎng)所內公用茶具大腸菌群的測定。

2定義

本標準采用下列定義。

大腸菌群coliform bacteria

指一群在37`C,24 h培養能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。

該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)被檢物的衛生質(zhì)量。

3儀器

3.1高壓蒸汽滅菌器。

3.2干熱滅菌箱。

3.3培養箱:36℃士I'C。

3.4水箱。

3.5電爐。

3.6天平。

3.7滅菌平皿:直徑9 Cm,

3.8滅菌刻度吸管:1 ML，10 ML,

3.9滅菌棉拭子。

3.10滅菌剪刀。

3.11 PH計或精密PH試紙。

4培養基和試荊

4. 1乳搪膽鹽發(fā)酵培養液

4.1.1成分:蛋白胨20 g

豬 膽 鹽(或牛 、 羊 膽 鹽)5g

乳 糖10g

0.04 %嗅 甲 酚 紫 水 溶 液25 mL

蒸 餾 水 1 000 mL

4.1.2制法:將蛋白脈、膽鹽及乳糖溶于蒸餾水中，調pH至7.4,加澳甲酚紫溶液，混勻，分裝到帶有倒管的試管中，每管10 mL。以115 `C高壓滅菌15 min。

注:雙 料 乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。

4.2伊紅美藍瓊脂

4.2.1成分:蛋白胨10g

乳 搪10 g

磷 酸 氫 二 鉀2 g

瓊脂17g

2%伊 紅 水 溶 液20mL

0. 65 %美 藍 溶 液 10 mL

蒸 餾 水1 0 00mL

4.2.2制法:將蛋白陳、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，調pH至7.1，分裝到燒瓶?jì)取?21`C高壓滅菌15 min備用，臨用時(shí)加人乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至50-55`C，加人伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。

4.3乳糖發(fā)酵管

4.3. 1成分;蛋白胨  20 g

乳糖 10g

0. 04 %澳 甲 酚 紫 水 溶 液25 mL

燕 餾 水1 0 00mL

4.3.2制法:將蛋白陳及乳糖溶于水中，調pH至7.4，加人指示劑，分裝到帶有倒管試管中，每管3 mL,115 C高壓滅菌15 min,

4.4革蘭氏染色液

4.4.1結晶紫染色液:

結 晶 紫1g

95 %乙 醇 20 mL

1%草 酸 錢(qián) 水 溶 液 80 mL

將 結 晶 紫溶于乙醇中，然后與草酸錢(qián)溶液混合。

4.4.2革蘭氏碘液:

碘 1g

碘 化 鉀 2g

蒸 餾 水 300m1

將 碘 與 碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL,

4.4.3脫色液:

95 %乙 醇

4.4.4沙黃復染液:

沙 黃  0.25g

95 %乙 醇  10 mL

蒸 餾 水 90 mL

將 沙 黃 溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

4.5染色法

4.5.1將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染色1 min，水洗。

4.5.2滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。

4.5.3滴加95%乙醇脫色，約30 s，水洗。

4. 5.4滴加復染液，復染1 min，水洗，待干，鏡檢。

4.6染色結果

革 蘭 氏 陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

4.7大腸菌群快速檢驗紙片

4.7.1質(zhì)量要求:紙片必須符合食(飲)具用大腸菌群快速檢驗紙片質(zhì)量標準。

4.7.2質(zhì)量標準:每張紙片5 cmX5 cm,pH值7. 0-7.4，包裝無(wú)菌，生產(chǎn)廠(chǎng)家經(jīng)衛生部門(mén)審核認可。

5檢驗程序

大腸菌群檢驗程序如下:

6操作步驟

6.1采樣方法

6.1.1隨機法:隨機抽取清洗消毒后準備使用的茶具

6.1.2涂抹法:使用測定細菌總數時(shí)采集的樣品，無(wú)需重采。

6.1.3紙片法:用滅菌生理鹽水濕潤5 cmX5 cm大腸菌群快速測定紙片兩張，分別粘貼在茶具內、外緣口唇接觸處，約30 s后取下，置于無(wú)菌塑料袋內。

6.2檢驗方法

6.2.1發(fā)酵法

6.2.1.1用測定細菌總數剩余的檢樣，倒人雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養液中。置36℃±1'C培養箱內培養24 h,

6.2.1.2觀(guān)察是否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，若有變黃和氣體產(chǎn)生，該管推測性檢驗陽(yáng)性。

6.2.1.3如不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣則為大腸菌群陰性。

6.2.1.4自推測性檢驗陽(yáng)性管中取一接種環(huán)培養液，轉種伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1'C培養箱培養18-24 h，然后取出，觀(guān)察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)性試驗。

6.2.1.5在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行染色鏡檢;同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1'C培養24 h。

6.2.2紙片法

將 已 采 樣的紙片置36℃士1'C培養箱內培養16^-18h，觀(guān)察結果。 

7結果報告

7.1發(fā)酵法

凡 乳 糖 發(fā)酵管最終產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，即可報告檢出大腸菌群。

7.2紙片法

紙 片 保 持紫藍色不變，則報告為大腸菌群陰性;紙片變黃，并在黃色背景上呈現紅色斑點(diǎn)或片狀紅暈，則報告檢出大腸菌群。

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