旱半夏組織培養條件的優(yōu)化研究

【摘要】  　　目的優(yōu)化旱半夏的組織培養條件。方法以旱半夏小塊莖為外植體進(jìn)行組織培養。結果與結論使用卡拉膠代替瓊脂固化，取得了良好的效果；旱半夏繼代增殖最適培養基為：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，增殖系數達到6.5，平均苗高達2.5 cm；生根最適培養基為：1/2MS+NAA 0.1 mg/L，生根數4～5條，生根率達到100%。

【關(guān)鍵詞】  旱半夏；組織培養；卡拉膠

　　Abstract：Objective To optimize tissue culture condition of pinellia tenata(Thumb)Breit.Methods With the tuber of Pinellia tenata(Thumb.)Breit as explant,the culture condition of tissue culture was optimized by tissue culture.Results and Conclusion The effect of κ-Carrageenan replacing of agar is good.The suitable subculture Proliferation medium is MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5 mg/L,the coefficient of proliferation get to 6.5,the average height is 2.5 cm,the suitable rooting medium is 1/2 MS+NAA0.1 mg/L,the rooting count is about 4～5,and the ratio of rooting gets to 100%.

　　Key words：Pinellia tenata(Thumb.)Breit;   Tissue culture;   κ-Carrageenan

    半夏pinellia tenata(Thunb.)Breit為天南星科多年生草本植物，以塊莖入藥，是一種重要的中藥材。其性溫，味辛，有小毒，歸脾、胃、肺，經(jīng)炮制后具有潤燥化痰、降逆止嘔、消痞散結之功效［1］。

    旱半夏多為野生，盡管具有明顯的雜草性，但其繁殖系數較低，又缺乏有效的傳播方式，因而是一種開(kāi)拓性差的物種［2］。近年來(lái)隨著(zhù)連年采挖，野生資源日趨枯竭，遠不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。人工栽培時(shí)，采用大塊莖出售，珠芽、小塊莖育苗，用種量大，成本高。小塊莖無(wú)性繁殖易使半夏產(chǎn)量降低，品質(zhì)退化，使半夏的栽培生產(chǎn)受到限制。利用組織培養建立半夏無(wú)性快速繁殖系統，可提高其繁殖系數，同時(shí)可防止品種退化問(wèn)題。
   
　　本研究主要是對半夏組織培養條件進(jìn)行優(yōu)化，為大規模進(jìn)行工廠(chǎng)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，前人研究中培養基使用瓊脂固化，本研究嘗試使用卡拉膠代替瓊脂固化，取得了良好的效果，卡拉膠較瓊脂價(jià)格低很多，因此可以為大規模進(jìn)行工廠(chǎng)化生產(chǎn)節約成本。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料旱半夏小塊莖， 購于安國市北方藥材種子經(jīng)銷(xiāo)站。

　　1.2  消毒方法

　　取健康的旱半夏小塊莖，用清水洗凈，放于超凈工作臺中滅過(guò)菌的空三角瓶中，先用含有吐溫的0.1%的升汞溶液消毒10～12 min，再用75%的酒精消毒30～60 s，最后再用無(wú)菌水沖洗5～6次，備用。

　　1.3  培養基及試驗

　　設計設計以MS、1/2MS為基本培養基，基于我們的研究目的旨在指導并應用于大生產(chǎn)，所以為盡量節約成本和適應大規模生產(chǎn)所需，本試驗選擇了細胞分裂素中效果較好且最為廉價(jià)常用的6-BA、生長(cháng)素選擇了NAA，以期篩選出適合于半夏生產(chǎn)的最佳培養基。

    發(fā)芽培養基：MS。   
　　繼代增殖培養基：在MS培養基中分別附加BA0.5，1.0，2.0，3.0 mg/L；NAA0.05，0.1，0.2，0.5 mg/L；采用二因素完全隨機設計（見(jiàn)表1）進(jìn)行最適激素配比的篩選，共計16個(gè)處理組合（見(jiàn)表2），每個(gè)處理接4株無(wú)菌苗，重復3次。表1  激素配比二因素完全隨機設計因素水平（略）

    生根培養基：在1/2MS培養基中分別附加0，0.01，0.05，0.10 mg/L NAA。

　　1.4 培養條件

　　所有培養基皆以濃度為0.7%的卡拉膠固化，含蔗糖均為3%，在高壓滅菌前將pH值調至5.8，溫度為（25±2）℃。光照1 500～2 000 lx，每日光照時(shí)數12～14 h。

2  結果

　　2.1 無(wú)菌苗的獲得

　　將小塊莖接種到MS培養基中進(jìn)行發(fā)芽培養，培養4～7 d內進(jìn)行觀(guān)察統計發(fā)芽情況。觀(guān)察統計發(fā)現，當培養7 d時(shí)，小塊莖的發(fā)芽率達到了100%，繼續培養無(wú)菌苗長(cháng)勢良好。

　　2.2  繼代增殖培養

　　將小塊莖發(fā)芽得到的無(wú)菌苗接種到表2處理組合的培養基中，培養1周左右無(wú)菌苗上端死亡，而在基部開(kāi)始膨大，培養2周時(shí)形成愈傷組織（見(jiàn)圖1），培養3周時(shí)愈傷組織分化成苗（見(jiàn)圖2），培養4周時(shí)對其進(jìn)行觀(guān)察和相關(guān)數據統計。
   
　　從表2可見(jiàn)，1～6號培養基中組培苗沒(méi)有增殖，而7～16號培養基均有一定程度的分化增殖，但是差別相對較大。從分化出的苗的高度以及增殖系數來(lái)看11號培養基最佳，增殖系數達到6.5，平均苗高達2.5 cm。其他培養基的增殖系數分布在1.2～4.0之間，平均芽苗高分布在1.2～2.0之間。從而篩選出最適繼代增殖培養基為： MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L。繼代分化增殖情況見(jiàn)圖3。表2  植物激素配比對旱半夏繼代增殖培養的影響（略）

　　2.3 生根培養

　　選擇繼代培養后生長(cháng)健壯并且有一定高度的試管苗，將其分成單株，分別接種到生根培養基上培養，10 d后觀(guān)察并統計結果。見(jiàn)表3。表3  不同生長(cháng)素濃度對旱半夏生根的影響（）

    從表3可見(jiàn)，NAA的濃度以0.1 mg/L時(shí)為最佳濃度，可長(cháng)出4～5條根，生根率達到100%，從而篩選出最適生根培養基為：1/2MS+NAA0.1 mg/L，并且在此培養基上生長(cháng)的組培苗根部無(wú)愈傷組織形成，有利于下一步移栽的成活。

　　2.4  移栽

　　選擇生根良好的試管苗進(jìn)行移栽，移栽前，先將試管苗從培養室中移至氣溫較低的室內進(jìn)行練苗2～3 d，而后再在室內開(kāi)瓶練苗2～3 d，最后，在瓶?jì)燃由僭S自來(lái)水練苗1～2 d后將其移栽至經(jīng)高壓滅菌的栽培土中，栽苗后需澆透水，初期加蓋覆蓋物，保溫保濕，管理期間，土壤切忌太濕和應注意保持空氣濕度。當確定苗已經(jīng)成活并且長(cháng)勢良好時(shí)，再將覆蓋物去掉暴露在空氣中生長(cháng)。

　　3 討論

    旱半夏分化增殖最適培養基為：MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，增殖系數達到6.5，平均苗高達2.5 cm；生根最適培養基為：1/2MS+NAA0.1 mg/L，生根率達到100%。
   
　　在生根過(guò)程中選苗是很關(guān)鍵的，苗的高度不是主要因素，主要還是要看其健壯程度，細弱的苗生根移栽后是很難成活的。應選擇健壯且有一定高度的組培苗來(lái)進(jìn)行生根培養，生根后根部應沒(méi)有愈傷組織形成，如果有愈傷組織即使根長(cháng)的很好，移栽后也很難成活。移栽時(shí)最好在根長(cháng)1～1.5 cm之間時(shí)，根長(cháng)的太長(cháng)后已老化，吸收養分的能力下降導致苗不易成活。

【參考文獻】
  　�。�1］國家藥典委員會(huì ).中國藥典,Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000:89.

　�。�2］郭巧生.半夏研究進(jìn)展［J］.中藥研究與信息,2000,2(10):15.

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