海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
【摘要】目的 探討噬菌體法進(jìn)行結核桿菌快速培養的特異性及敏感性以及該方法與傳統方法的同源性。 方法 應用噬菌體法進(jìn)行結核分支桿菌、牛分支桿菌以及非結核分支桿菌的培養;同時(shí)應用噬菌體法與傳統的羅氏培養法進(jìn)行結核菌培養及藥敏測定。結果 該方法檢出最低濃度為103CFU/ml，特異性達到100%，藥敏實(shí)驗同傳統方法的符合率為83.3%，臨床涂陽(yáng)培陽(yáng)標本18例，本法陽(yáng)性16例，檢出率為88.8%，涂陰培陽(yáng)標本15例，本法陽(yáng)性8例，檢出率為53.5%，涂陰培陰標本17例，本法陽(yáng)性4例，檢出率為23.5%。結論 噬菌體裂解法具有很高的敏感性和特異性，同時(shí)與傳統方法比較具有較高的藥敏符合率。
【關(guān)鍵詞】 噬菌體 結核分支桿菌
現在大部分地區肺結核患者的診斷是依靠實(shí)驗室診斷、臨床癥狀和體征，而實(shí)驗室診斷最主要是依靠從有癥狀的初次就診病人的痰液標本進(jìn)行常規的涂片顯微鏡檢查，痰液涂片顯微鏡檢查將篩選大部分的結核感染病例。然而，眾所周知，這種檢查方法將漏診很多的結核感染病人，這些漏診的病人就是感染源。經(jīng)過(guò)消化處理或去污染處理的痰標本結核桿菌培養方法是診斷肺結核的較為敏感的方法，然而這種方法需要耗費幾周的時(shí)間，從而不能及時(shí)診斷肺結核，導致結核病的傳播。因而結核病細菌學(xué)快速檢查歷來(lái)是國內外學(xué)者所關(guān)注的熱門(mén)課題［1，2］ 。
目前耐藥、流動(dòng)人口、HIV感染已經(jīng)成為當今結核病控制所面臨的三大難題。其中耐藥性是我國結核病起主要限制性作用的因素。因而結核菌的培養和藥敏結果在結核病的防治中起著(zhù)重要作用。
我們通過(guò)噬菌體裂解法對結核分支桿菌及非分支桿菌進(jìn)行了快速培養與鑒定，同時(shí)進(jìn)行了藥物敏感性測定，并與傳統的羅氏培養法進(jìn)行了比較�，F報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料 結核分支桿菌快速診斷試劑盒（Fast plaque TB TM ）由北京華誠沛豐生物技術(shù)有限公司提供。結核分支桿菌、牛分支桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌來(lái)自吉林市結核病防治研究所臨床菌株。結核病患者痰標本50份，其中涂陽(yáng)培陽(yáng)標本18份，涂陰培陽(yáng)標本15份，涂陰培陰標本17份。
1.2 方法 按試劑說(shuō)明書(shū)操作，主要步驟如下。
2 結果
2.1 應用10例結核分枝桿菌分別在10 2 、10 3 、10 4 、10 5 、10 7 CFU/ml濃度，（Mcfarland3.0濁度相當于細菌濃度107CFU/ml）進(jìn)行噬菌體法檢測結核菌。該方法檢出最低濃度為103CFU/ml。詳見(jiàn)表1。
表1 噬菌體法檢測不同濃度結核菌的結果（略）
2.2 噬菌體法結核菌培養的特異性實(shí)驗 銅綠假單胞菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌4種呼吸道常見(jiàn)細菌各10株應用噬菌體法檢測均為陰性。牛分支桿菌、結核分支桿菌各10株，進(jìn)行噬菌體法結核菌檢測均為陽(yáng)性。（菌液濃度均為10 5 CFU/ml）其特異性達到100%。
2.3 噬菌體法進(jìn)行藥物耐藥性分析，噬菌體法藥敏實(shí)驗同傳統方法的符合率為83.3%，分別為S90%、R90%、H70%。詳見(jiàn)表2。
2.4 肺結核患者臨床痰標本50株，直接進(jìn)行噬菌體法結核菌檢測。涂陽(yáng)培陽(yáng)標本檢出率為88.8%，涂陰培陽(yáng)標本檢出率為53.3%，涂陰培陰標本檢出率為23.5%，詳見(jiàn)表3。
表2 噬菌體法與傳統羅氏法兩種方法藥敏實(shí)驗的比較（略）
注:敏感“-”，耐藥“+”，羅氏法低濃度耐藥高濃度敏感“+-”;噬菌體法菌液濃度均為10 4 CFU/ml;噬菌體法可疑“?”
表3 50例肺結核患者臨床痰標本的噬菌體法檢測結果（略）
3 討論
分支桿菌噬菌體在1947年由Gardner首次分離并命名，之后，不同種分支桿菌噬菌體陸續被分離，至今已分離出250余種 ［3］ 。隨著(zhù)人類(lèi)對噬菌體結構和功能的不斷認識，噬菌體作為一種研究工具的功能正逐步被開(kāi)發(fā)，一些相關(guān)機制如L5、D29的全基因序列已逐步被闡明 ［4］。近20年來(lái)，分支桿菌噬菌體廣泛用于DNA重組技術(shù)中，并已在分支桿菌快速鑒定及藥物敏感性試驗中得以廣泛應用［5，6］ 。北京華誠沛豐生物技術(shù)有限公司提供的FAST Plauqe TB是一種用噬菌體方法檢測待檢標本中是否存在活的結核分支桿菌的檢測方法。該方法的基本原理是分支桿菌噬菌體只能感染相應的活的分支桿菌，如待檢標本中無(wú)相應的分支桿菌，則噬菌體被隨后加入的殺毒劑全部殺死，因而后加入的提示細胞未受噬菌體感染，只能在培養皿中生長(cháng)繁殖，無(wú)噬菌斑出現［7］ 。但如待檢標本中有相應的分支桿菌，則噬菌體侵入菌體內，免遭殺毒劑破壞，并在菌體內大量增殖，最終裂解菌體，釋放出來(lái)的噬菌體即可感染指示細胞，并使指示細胞裂解出現噬菌斑。因此，只要根據噬菌斑的有無(wú)，即可確定待檢標本中是否含有相應的活的分支桿菌。
本研究結果表明，菌液濃度達到10 3 CFU/ml就能檢測出來(lái)（涂片檢出濃度為10 4 CFU/ml），因此具有較高的靈敏度。特異性試驗結果表明只有結核分支桿菌才出現陽(yáng)性結果，而4種呼吸道常見(jiàn)菌檢測結果均為陰性，說(shuō)明特異性達到100%。藥敏實(shí)驗結果表明本法與傳統羅氏培養法的藥敏符合率達到83.3%，說(shuō)明二者之間具有較好的同源性。臨床標本檢驗結果表明，涂陽(yáng)培陽(yáng)標本檢出率為88.8%，涂陰培陽(yáng)標本檢出率為53.3%，涂陰培陰標本檢出率為23.5%，平均檢出率達到56.0%，大大高于涂片30%的檢出率。而報告時(shí)間（2～4天）明顯低于傳統方法培養所需要的時(shí)間（2～3個(gè)月）。由上述研究結果可看出，本法快速、簡(jiǎn)便，同時(shí)具有很高的敏感性和特異性，是一種較理想、有發(fā)展前途、對結核病有診斷及治療意義的新方法。同時(shí)，由于噬菌體的裂解作用，實(shí)驗過(guò)程中能將結核分支桿菌殺死，對實(shí)驗操作人員有保護作用，而且無(wú)須特殊儀器，成本低廉，易于我國實(shí)驗室推廣［8，9］ 。
參考文獻
1 唐神結，肖和平.分支桿菌快速分離培養技術(shù)研究進(jìn)展.中華結核和呼吸雜志，2000，23:762-764.
2 Badak ZF，Kiska DL，Setterquist S，et al.Comparison of mycobacteria growth indicator tube with BACTEC460for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens.J Clin Microbiol，1996，34:2236-2239.
3 McNemey R.TB:the return of the phage.A review of fifty years of my-cobacterrphage research.Int J Tuberc Lung Dis，1999，3:179-184.
4 Ford ME，Sarkis GJ，Belanger AE，et al.Genome structure of mycobacte-riophage D29:implications for phage evolution.J Mol Biol，1998，279:143-164.
5 呂斌，徐順清，符志軍，等.利用重組分支桿菌噬菌體快速篩選耐利福平結核分支桿菌.中華結核和呼吸雜志，2000，23:480-483.
6 Carriere C，Riska P，Zimhony O，et al.Conditional replicating luciferase reporter phages:improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，1997，35:3232-3239.
7 Wren BW，Stabler RA，Das SS，et al.Characterization of a haemolysin from Mycobacterium tuberculosis with homology to a virulence factor of Serpulina hyodysenteriae.Microbiol，1998，144:1205-1211.
8 Elteringham IJ，Wilson SM，Drobniewski FA.Evaluation of a bacterio-phage-based assay（phage amplified biologically assay）as a rapid screen for resistance to isoniazid，ethambutol，streptomycin，pyrazi-namide，and ciprofloxacin among clinical isolates of Mycobacterium tu-berculosis.J Clin Microbiol，1999，37:3528-3532.
9 McNerney RP，Kiepiela KS，Bishop PM，et al.Rapid screening of My-cobacterium tuberculosis for susceptibility to rifampicin and strepto-mycin.Int J Tuberc Lung Dis，2000，4:1-7.
