微量法檢測曲霉對六種抗真菌藥物的敏感性

1997年美國國家臨床實(shí)驗室標準委員會(huì )（NCCLS）公布了M27-A方案，即酵母菌的液體培養基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗標準方案，表明酵母菌的體外藥敏試驗已趨于標準化，而絲狀真菌藥敏試驗還在不斷發(fā)展。我們以此方案中的微量法為基礎，探討并建立曲霉的標準化藥敏試驗方法。

　　一、材料和方法

　　1.試驗菌株來(lái)源：受試菌株31株：煙曲霉14株、黃曲霉8株、黑曲霉5株、構巢曲霉3株和土曲霉2株。試驗菌株由臨床株和環(huán)境株組成，主要由北京醫科大學(xué)第一醫院、中國科學(xué)院微生物研究所等提供。

　　2.抗真菌藥物包括：5-氟胞嘧啶（5-FC） 和兩性霉素B（AmB）由Sigma公司提供，氟康唑（FCZ）由三維制藥公司提供，酮康唑（KCZ）和伊曲康唑（ICZ）由楊森制藥公司提供，特比萘芬（TBF）由諾華制藥公司提供，貯存液的制備詳見(jiàn)參考文獻［1］。

　　3.培養基：RPMI-1640液體培養基，唯有TBF試驗用2%沙氏液體培養基(SDB)。

　　4.方法：參照NCCLS方案（1997年版）^［2］進(jìn)行，但有如下幾點(diǎn)說(shuō)明。(1)TBF藥液制備：TBF貯存液用SDB稀釋?zhuān)�終濃度0.0313～16 μg/ml。(2)菌懸液制備：將受試菌株在麥芽培養基30℃生長(cháng)7～10天，菌懸液經(jīng)振蕩和培養基稀釋?zhuān)�其終濃度至0.5×10⁴～2.5×10⁴CFU/ml。(3)結果判定：經(jīng)30℃培養46～50小時(shí)后觀(guān)察結果。本試驗結果AmB取0：肉眼清晰為判定終點(diǎn)，其余5種藥物取Ⅰ：略模糊（80%受抑制）或Ⅱ：濁度顯著(zhù)減低（50%受抑制）為判定終點(diǎn)^{［2，3］}。

　　三、結果

　　1、6種抗真菌藥物對31株曲霉的MIC值的幾何均數及MIC值范圍見(jiàn)表1。ICZ與TBF對31株曲霉的MIC值的幾何均數較低，ICZ僅對3株曲霉的MIC值≥1 μg/ml，其中對2株的MIC值為1 μg/ml，對1株的MIC值為2 μg/ml；TBF對4株曲霉菌的MIC值≥1 μg/ml，其中3株MIC值為1 μg/ml，對1株MIC值為2 μg/ml；AmB的MIC值集中在1 μg/ml或2 μg/ml，其中AmB對15株的MIC值＞1 μg/ml，其中MIC值為2 μg/ml、4 μg/ml和8 μg/ml者分別為10株、3株和2株；KCZ對20株曲霉菌的MIC值＞1 μg/ml；FCZ對12株曲霉菌的MIC值≥64 μg/ml；5-FC對20株曲霉菌的MIC值≥32 μg/ml，其中11株的MIC值為32 μg/ml，9株的MIC值≥64 μg/ml。

　　2.將6種藥物對曲霉菌的MIC值進(jìn)行秩和檢驗，結果表明，ICZ和TBF對曲霉菌的MIC值均值明顯低于其他4種藥物(P＜0.01)。

表1　6種抗真菌藥物對5種曲霉菌的MIC值幾何均數及范圍(μg/ml)

　　注：5-FC：5-氟胞嘧啶；FCZ：氟康唑；KCZ：酮康唑；ICZ：伊曲康唑；AmB：兩性霉素B；TBF：特比萘芬四、討論

　　目前絲狀真菌藥敏試驗的理想條件是：(1)接種濃度10⁴CFU/ml；(2)孵育時(shí)間48～72小時(shí)；(3)終點(diǎn)判讀宜通過(guò)比色法，得到更為精確的MIC值^{［3，4］}。

　　在試驗中，ICZ、TBF的MIC值較低，顯示曲霉菌對這兩種藥物高度敏感，其中MIC值≥1 μg/ml的菌株，ICZ僅有3株，TBF僅有4株。資料表明^［5］，臨床治療中發(fā)現的ICZ耐藥菌株，其MIC值≥16 μg/ml，而本試驗ICZ的MIC值全部小于16 μg/ml，說(shuō)明目前國內曲霉菌株仍對ICZ高度敏感，尚未發(fā)現耐藥株；資料^［6］表明，TBF對曲霉有較強的抑菌作用，其均值MIC50/MFC90為0.4～1.6 μg/ml，其耐藥標準與AmB相當，在與AmB、KCZ、5-FC相比的曲霉藥敏試驗中，其敏感性明顯高于這些藥物，表明TBF有可能用于曲霉病的治療。AmB和KCZ的MIC值較高，其中MIC值＞1 μg/ml的菌株分別為15株和20株；對于5-FC和FCZ，依據M27-A方案念珠菌的耐藥標準，5-FC的MIC值≥32 μg/ml的菌株有20株，FCZ的MIC值≥64 μg/ml的菌株有12株，表明后4種藥物對曲霉的敏感性較差。值得說(shuō)明的是，31株曲霉菌中AmB的MIC值＞1 μg/ml有15株，而臨床工作中，AmB治療曲霉病有較好的療效^［5］，這一點(diǎn)可能恰好反映出M27-A方案本身對AmB的耐藥性檢測不敏感的問(wèn)題。

　　志謝　本課題得到北京醫科大學(xué)第一臨床醫院諾華真菌研究中心的資助

　　參考文獻

　　[1]　王文莉，王端禮，李若瑜，等.酵母菌的NCCLS藥敏試驗方法及其應用.中華醫學(xué)檢驗雜志，1997,20:119-122.

　　[2]　National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard M27-A. Pennsylvania:NCCLS, 1997.1-21.

　　[3]　Espinel-Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. J Clin Microbiol，1997,35:139-143.

　　[4]　劉偉，李若瑜，王端禮．絲狀真菌藥敏試驗的研究進(jìn)展.中華醫學(xué)檢驗雜志，1997,20:313-315.

　　[5]　Denning DW,Venkateswarlu K, Oakley KL,et al. Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Chemother，1997,41:1364-1368.

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