金黃色葡萄球菌隨機引物擴增DNA多態(tài)性的分型研究
錄入時(shí)間:2010-11-24 11:32:37
來(lái)源：CNKI
隨機擴增DNA的多態(tài)性(RAPD-DNA)分型是近年來(lái)繼質(zhì)粒譜分析、脈沖場(chǎng)電泳、探針雜交等分子生物學(xué)分型方法之后，發(fā)展起來(lái)的又一基因分型技術(shù)，在建立后的短短幾年內，它已在醫院感染菌株基因多態(tài)性分析中，顯示了巨大的優(yōu)勢。為此，我們對金黃色葡萄球菌進(jìn)行RAPD基因分型，以探討其在醫院感染研究中的意義。
一、材料與方法
1.菌株來(lái)源：1998年2月～1999年4月住廣州市三所綜合性醫院患者，分別取自痰、血液、傷口分泌物、腹水等臨床標本，經(jīng)分離鑒定確定為金黃色葡萄球菌，共85株。醫院感染72株，社區感染13株。由一個(gè)實(shí)驗室統一鑒定到種。所有菌株-70℃冰箱保存。
2.醫院感染診斷標準：參照衛生部醫政司醫院感染監控協(xié)調小組制定的診斷標準。
3.工具酶及主要試劑：蛋白酶K、Taq DNA聚合酶及dNTPs均購自上海生物試劑公司。
4.DNA提�。�500 μl LB液體培養基增菌，加入25 μl蛋白酶K，10%SDS10 μl 37℃溫育1小時(shí)。酚、氯仿、異戊醇抽提，無(wú)水乙醇沉淀，溶解于50μl雙蒸水中，低溫保存。
5.引物：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′由中國科學(xué)院上海生物工程有限公司合成。
6.聚合酶鏈反應(PCR)條件：反應體積為50 μl，含引物2.0 μmml/L，4種dNTP各125μmml/L，鎂離子濃度3.5 μmml/L，待測模板1 μl，Taq聚合酶1 U。PCR反應條件：92℃1 min，25℃ 2 min，65℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，擴增產(chǎn)物在70 mV電壓，2 h，2%的瓊脂糖凝膠電泳，透射紫外儀下照相觀(guān)察。
二、結果
RAPD分型結果：可擴增出1～8帶，共分為37個(gè)基因型。3株未分型。
三、討論
應用隨機引物PCR進(jìn)行指紋圖譜分析，相同引物，反應控制的條件(如退火溫度鎂離子濃度、模板濃度)不同，所得指紋圖譜亦不相同，進(jìn)行PCR循環(huán)時(shí)退火溫度一般選擇在25～35℃，40℃以上時(shí)擴增效率逐漸減弱，另外鎂離子濃度對擴增也有影響，隨著(zhù)鎂離子濃度的增加，長(cháng)的擴增帶逐漸增多，短的擴增帶逐漸減少，一般認為鎂離子濃度在3.5～4.5 mmol/L時(shí)，長(cháng)短片段均能得到良好的擴增［1，2］。與肖征等［3］報道相比，我們選擇了更低的退火溫度及穩定的鎂離子濃度，以確保RAPD的分辨率。該方法具有常規PCR技術(shù)的快速、安全、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)，而且其引物是通用的，不必預先知道該物種的基因序列。在醫院感染研究部門(mén)中，應用相同的引物，可用于不同細菌的快速流行病調查，尤其是暴發(fā)流行的調查，為及時(shí)控制感染爭取了時(shí)間，所以，該技術(shù)為醫院感染分子流行病學(xué)研究提供了切實(shí)可行的研究方法。
本研究分型結果提示，三所醫院之間基因型差別較大，且同一醫院醫院感染株與社區感染株基因型完全不同。說(shuō)明在同一醫院內菌株存在著(zhù)流行趨勢，A醫院社區感染株基因型相近但不相同，可能與來(lái)就診患者相對集中在該社區有關(guān)。另外B醫院與C醫院無(wú)論是醫院感染株，還是社區感染株基因型均存在相同或相近，從地理位置上而言，這兩所醫院距離相對較近(約2公里)，離A醫院均較遠(10公里)。進(jìn)一步說(shuō)明了菌株流行趨勢，不僅與是否為醫院感染株有關(guān)，與地理位置亦有關(guān)。國內學(xué)者賀學(xué)英等［4］應用脈沖場(chǎng)電泳分型對金黃色葡萄球菌的研究認為醫院感染株為小流行，社區感染株為散發(fā)，與本文觀(guān)點(diǎn)不完全相同。
從1998年1月初～11月底，A醫院神經(jīng)外科13例不同時(shí)期住院的患者不同部位的分離株，分別有6株和7株分為兩個(gè)基因型，說(shuō)明這些菌株是同源的，同一病區存在著(zhù)交叉感染，同一病區可有不同的基因型流行，同一菌株可以長(cháng)期流行。英國報道［5］在一所醫院的重癥監護病房病區6個(gè)月分離出17株耐甲氧苯西林金黃色葡萄球菌，其中1株來(lái)自護理員的手，16株來(lái)自患者，16/17株具有相同基因型，說(shuō)明護理員的手可能是造成傳播的感染源。有文獻報道［6］呼吸道及鼻腔攜帶往往是其重要的感染源，通過(guò)健康工作人員手及空氣傳播造成感染，而且這種感染方式往往是造成暴發(fā)流行的主要原因。嚴格洗手、操作時(shí)戴口罩、加強消毒隔離措施是控制金黃色葡萄球菌交叉感染的根本措施。
基金項目：廣東省衛生廳科研項目資助(A980124)；廣東現代醫院管理研究所科研基金資助
參考文獻
1 Welsh JG, Meclellang M. Finger printing genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Res, 1990,18：7213-7238.
2 Williams J, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphism′s amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res, 1990,18：6531-6535.
3 肖征，吳堅，楊繼勇，等.重復片段引物聚合酶鏈反應應用于醫院感染流行病學(xué)研究.中華醫學(xué)檢驗雜志，1999，22：232-234.
4 賀學(xué)英，周惠平.PFGE方法在醫院感染病原學(xué)監測中的應用.中華醫院感染學(xué)雜志，1998，8：75-77.
5 Tambic A, Power EG, Analysis of an outbreak of non-phage-Typeable methicillin-resistant Staphylococcus aureus by using a randomly amplified polymorph DNA assay. J Clin Microbiol, 1997,35：3092-3097.
6 Pujol M, Prna C, Pallares R, et al. Nosocomial staphylococcus aureus among nasal carriers of mrthcillon resistant and methcillin srscwptibic strains. an J Med, 1996,100：509-513.
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