細菌快速裂解方法研究

16S-23S rRNA基因是位于16S rRNA基因與23S rRNA基因之間的區間序列，具有較好的保守性和相對的可變性，被認為是細菌鑒定的合適部位［1，2］。我們認為能否快速有效地擴增該區間，聚合酶鏈反應(PCR)擴增前的標本處理是關(guān)鍵。故比較了3種裂解細菌的方法。
　　一、材料與方法
　　1.菌株、人類(lèi)基因組DNA及病毒株來(lái)源：革蘭陽(yáng)性6個(gè)菌種，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株；革蘭陰性21個(gè)菌種，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、綠膿假單胞菌等共40株。以上菌株由浙江省臨床檢驗中心及結核病防治中心提供，保存于我院細菌室。人類(lèi)基因組DNA、新型隱球菌、巨細胞病毒由本院中心實(shí)驗室提供。
　　2.臨床標本：1999年6月～2000年3月本院新生兒住院患兒，部分為普通病房住院患兒。敗血癥血標本42份，腦脊液標本6份。對照組15份，為本院新生兒病房非感染患兒康復期待出院者的血標本。
　　3.16S-23S rRNA基因區間序列引物設計：在細菌的16S rRNA基因的3′端及23S rRNA基因的5′端的保守序列內，經(jīng)計算機軟件查閱自行設計引物。
　　4.臨床標本處理：血標本：0.5 ml的肝素抗凝血置室溫約10 min以沉淀血細胞，在血清與血細胞的交界面（即白細胞層）吸取200 μl，注入1.5 ml滅菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl 1 ml，搖勻，放入37℃水浴箱中。15 min后，取出，1 000 r/min離心5 min，去上清液，在沉淀物中加NH4Cl 1 ml，重復上述步驟2次。最后在沉淀物中加5% Chelex 100緩沖液（含0.03% SDS，1%吐溫 20，1% NP 40 ）200 μl和蛋白酶K 2 μl（20 mg/ml），56℃孵育60 min后煮沸15 min，稍加離心后，取上清液做PCR擴增。
　　腦脊液標本：0.5 ml～1 ml腦脊液1 000 r/min離心1 min，去上清液，在沉淀物中加5% Chelex 100緩沖液200 μl和蛋白酶K 2 μl，56℃孵育 60 min后再煮沸15 min，稍加離心后，取上清液做PCR擴增。
　　二、結果
　　1.Chelex 100改良裂解法能裂解所研究的所有菌種，且擴增產(chǎn)物條帶清晰，效果滿(mǎn)意。用經(jīng)典的酚氯仿抽提法擴增細菌，效果同Chelex 100改良法，但步驟繁瑣［3］。
　　2.臨床標本的裂解：42例新生兒敗血癥血培養15例陽(yáng)性，血標本經(jīng)改良Chelex 100裂解，PCR擴增后27例陽(yáng)性，其陽(yáng)性率明顯高于血培養，差異有顯著(zhù)性意義（P＜0.01）。血培養陽(yáng)性的15例PCR檢測均陽(yáng)性，且檢測結果與血培養一致。另1組單純用水煮裂解，只有5份陽(yáng)性。6份腦脊液培養2例陽(yáng)性，腦脊液PCR檢測4例陽(yáng)性，培養陽(yáng)性的2例與PCR結果相符。15份對照組血標本血培養及PCR檢測均陰性。
　　3.敏感性及引物特異性試驗：取潘尼變形桿菌標準菌株放入1 ml的dd H2O中，用麥氏比濁法確定起始濃度為108 CFU ，用dd H2O 1∶10定量稀釋?zhuān)瑵舛确秶鸀?SPAN lang=EN-US>2.5×104～2.5×10-3CFU，取2 μl模板在50 μl的PCR體系中擴增，檢測擴增下限。Chelex 100緩沖液裂解法得PCR的最小檢出量為2.5 CFU/ml。本對引物只能擴增細菌，與人基因組DNA、新型隱球菌、巨細胞病毒無(wú)交叉反應，說(shuō)明本對引物擴增細菌16s-23srRNA基因有較好的特異性。
　　三、討論
　　本研究首次在Chelex 100的基礎上進(jìn)行改良，加上其他一些試劑配成一種適合不同菌種（包括葡萄球菌在內）PCR擴增的裂解液。并發(fā)現用Chelex 100改良法裂解細菌后所擴增的條帶較明亮清晰，效果滿(mǎn)意，可檢測2.5 CFU/ml的細菌，敏感性比水煮法提高了100倍。用經(jīng)典的酚/氯仿抽提細菌DNA再行PCR擴增，效果與Chelex 100改良法相同。但經(jīng)典的方法步驟較繁瑣，DNA經(jīng)常從1管轉移到另1管，且還要使用多種試劑，這都增加了PCR污染的可能性。故Chelex 100改良裂解法是一簡(jiǎn)便有效的方法，適合于不同菌株的擴增。
　　總之，經(jīng)標準菌株和臨床標本的初步應用，證明本研究建立的用Chelex100 改良法一步擴增細菌的16S-23S rRNA基因區間具有準確、敏感、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，若經(jīng)大量臨床標本的進(jìn)一步證實(shí)，可成為一理想的診斷技術(shù)。
　　基金項目：浙江省自然基金資助項目(398426)
　　參考文獻
　　1，Roth A, Fischer M, Hamid ME, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol, 1998,36:139-147.
　　2，傅君芬，洪文瀾.16S-23S rRNA 區間序列——一種分型及鑒別細菌的新方法《國外醫學(xué)》流行病. 傳染病分冊,1998,25：245-249.
　　3，尚世強 ，洪文瀾 ，俞惠民，等. 細菌DNA的聚合酶鏈反應擴增及反相雜交初步分型. 中華醫學(xué)檢驗雜志 ,1998,21：281-284.

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