白蘚組織培養及無(wú)性系建立的研究

【摘要】  　　目的對白蘚資源進(jìn)行種質(zhì)保存，滿(mǎn)足人們栽培對種苗的需求。方法以白蘚嫩莖為材料，以植物組織培養方法為手段，進(jìn)行了愈傷組織誘導，愈傷組織和不頂芽分化，試管苗生根，試管苗移栽、扦插和移植的研究。結果1/2MS+BA0.5 mg•L-1+NAA1.0～1.5 mg•L-1為嫩莖愈傷組織的誘導培養和繼代培養的理想培養基；MS+AgNO31.5mg•L-1+BA0.8mg•L-1+naa0.2mg•L-1是嫩莖愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基；1/3MS+IAA0.4～0.6mg•L-1是生根培養和試管苗生根繼代培養的理想培養基；移栽的試管苗保持了野生白蘚的所有生物學(xué)性狀，成功地建立起白蘚的無(wú)性系。結論嫩芽誘導的愈傷組織建立的無(wú)性系能對其進(jìn)行種質(zhì)保存，所繁殖的種苗能滿(mǎn)足人們栽培的需求。 
【關(guān)鍵詞】  白蘚； 愈傷組織； 無(wú)性系； 快速繁殖
    白蘚Dictamnus dasycarpus，又稱(chēng)八股牛，屬于蕓香科白蘚屬多年生草本植物，生長(cháng)于山坡、林下、林緣和草地。在我國的東北、華北、西北和華東等地有分布，朝鮮、蒙古和俄羅斯也有分布［1～3］。白鮮葉可提取芳香油；根莖作農藥用，可防治多種病蟲(chóng)害；根皮（白蘚皮）入藥，具有解毒、祛熱、利尿、除濕和殺蟲(chóng)等功效，能治皮膚瘙癢、濕疹、黃水瘡、黃疸、肝炎和陰部瘙癢等疾�。�3～5］。由于白蘚既可作無(wú)公害的農藥，又是治療多種疾病的中藥，從而出現了人們大量采收，數量越來(lái)越少的現象。于是，遼寧南部地區有人試圖對其進(jìn)行栽培，但由于人們長(cháng)期地過(guò)量采挖，已經(jīng)難以收集到種子，只能將有限的野生植株挖回來(lái)作為種苗，這又使數量非常少的野生白蘚資源遭到了破壞。于是，我們對白蘚進(jìn)行了組織培養及無(wú)性系建立的研究，以期滿(mǎn)足人們栽培對種苗的需求。雖然已多有蕓香科植物組織培養研究的報道［6～9］，但迄今未見(jiàn)白蘚組織培養及無(wú)性系建立的研究的報道。本研究以白蘚的嫩莖為材料，成功地誘導形成愈傷組織，建立起無(wú)性系。
　　1  材料
　　1.1 材料及滅菌五月上旬至中旬，將林緣草地上長(cháng)勢非常旺盛的白蘚嫩莖切下后，放到500 ml的磨口廣口瓶中，用自來(lái)水振蕩洗滌30 min左右，再用0.05 %安利洗滌液振蕩洗滌20 min左右，然后移到超凈工作臺上，用70%～75%的乙醇滅菌約15 s后，迅速用無(wú)菌水振蕩洗滌2次，倒入0.05 % HgCl2 溶液振蕩滅菌3 min，接著(zhù)用0.025 % HgCl2 溶液振蕩滅菌8 min，再用無(wú)菌水振蕩洗滌6次漓干后，將裝有材料的瓶子置于27℃的溫箱中放置24 h，然后再用0.025%HgCl2滅菌6 min，接著(zhù)用無(wú)菌水洗滌6次。即可獲得白蘚無(wú)菌嫩莖。
　　1.2  培養條件以MS，1/2MS，1/3MS為基本培養基，附加不同種類(lèi)不同濃度的BA，IBA，IAA，NAA和2,4-D。以MS為基本培養基加蔗糖30 g•L-1，以1/2MS為基本培養基加蔗糖15 g•L-1，以1/3MS為基本培養基加蔗糖10g•L-1。培養基胨力強度為180 g/cm2［10］，pH為5.8～6.0，培養溫度20～25℃，光照度3 000 Lx左右，光照10～12 h•d-1。
　　2  方法
　　2.1  不同培養基對愈傷組織的誘導的影響
　　將無(wú)菌嫩莖用解剖刀切成長(cháng)約0.2 cm的無(wú)生長(cháng)點(diǎn)莖段，接種到附加不同濃度BA、IBA、NAA的1/2MS培養基上，進(jìn)行愈傷組織的誘導培養。培養到50d時(shí)觀(guān)察統計培養結果。嫩莖愈傷組織的誘導試驗重復了3次，每次試驗繼代培養5代。
　　2.2  不同激素愈傷組織分化的影響 
 
　　將繼代培養45 d生長(cháng)一致的愈傷組織顆粒分散成獨立的顆粒后，接種到以MS+ AgNO31.5 mg•L-1為基本培養基，附加不同濃度BA、2,4-D或NAA的培養基中，進(jìn)行愈傷組織的分化培養。每種培養基接種100個(gè)愈傷組織顆粒，統計觀(guān)察分化率和分化不定芽的生長(cháng)狀況。
　　2.3  不同濃度IAA對不定芽生根的影響
　　把上述繼代培養的叢生狀、生長(cháng)旺盛、高0.5 cm以上的不定芽從基部剪下，接種到以1/3MS為基本培養基，附加濃度分別為0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 ，1.2 mg•L-1和1.4 mg•L-1的IAA培養基上，進(jìn)行不定芽的生根培養。生根實(shí)驗重復了3次，每次試驗接種200個(gè)不定芽。
　　2.4  試管苗的移栽、扦插把繼代培養的生根試管苗培養瓶移到日光溫室中，除掉培養瓶瓶塞，在4000～7000Lx光照下煉苗4 d，用鑷子將試管苗取出，在清水中洗去根部培養基后，移栽到上面分別鋪著(zhù)一層厚為6～7 cm的河沙、珍珠巖、山皮土、園土、爐灰渣（小顆粒狀）5種移栽基質(zhì)、下面為肥沃園土的溫室苗床上。移栽后前15 d保持相對濕度為95％左右、溫度20～28℃、沒(méi)有直射光的條件。
    
　　把經(jīng)過(guò)上述煉苗4 d的試管苗取出后，剪成長(cháng)2cm左右，至少具有兩個(gè)腋芽或一個(gè)頂芽和兩個(gè)腋芽的莖段后，將最下面的一個(gè)葉片剪掉后，把下部切口在濃度為90 mg•L-1的IAA溶液中浸泡處理4～6 min后取出，直接扦插到上面覆蓋著(zhù)一層上述五種事先已經(jīng)澆透水的移栽基質(zhì)的苗床上，并采用與移栽相同的條件進(jìn)行管理。
3  結果
　　3.1  不同培養基對愈傷組織的誘導的影響由表1可見(jiàn)，接種到附加不同濃度BA、IBA的培養基中不能誘導形成愈傷組織；接種到附加不同濃度BA、NAA的培養基上都能誘導形成愈傷組織。但從愈傷組織的誘導率和長(cháng)勢看兩個(gè)方面看，以8、9號兩種培養基的誘導效果好。在這兩種培養基上培養的材料，不僅誘導率達100％，而且愈傷組織長(cháng)勢好。觀(guān)察還表明，接種在這兩種培養基上的外植體，培養到10 d時(shí)，大部分培養材料在切口部開(kāi)始出現愈傷組織，隨后愈傷組織開(kāi)始迅速生長(cháng)。初期形成的愈傷組織為無(wú)色、光滑的半透明狀，后來(lái)逐漸生長(cháng)變化成為直徑在0.1cm左右的綠色顆粒狀。
    
　　把上述兩種培養基上由嫩莖誘導培養的、生長(cháng)狀態(tài)一致的綠色顆粒狀愈傷組織分散為獨立的顆粒后，接種到相同的培養基上進(jìn)行愈傷組織的繼代增殖培養。在相同的培養條件下培養45 d。經(jīng)過(guò)3次重復試驗，每次重復試驗繼代培養5代的研究證明：初期培養的愈傷組織為淺綠色顆粒，后來(lái)伴隨著(zhù)顆粒狀愈傷組織的迅速生長(cháng)增殖，逐漸變成為綠色的顆粒。培養45 d的增殖系數為28.5。上述試驗結果說(shuō)明，1/2MS+BA0.5 mg•L-1+NAA1.0～1.5 mg•L-1的培養基為白蘚嫩莖顆粒狀愈傷組織的誘導培養和繼代培養的理想培養基。表1  不同培養基對愈傷組織誘導的影響（略）
　　3.2  不同激素對愈傷組織分化的影響由表2可以看出，在不同濃度的BA與不同濃度NAA配合使用的培養基上，顆粒狀愈傷組織的分化情況較好，尤其是濃度為0.8 mg•L-1的BA與濃度為0.2 mg•L-1的NAA培養基上，不僅愈傷組織的分化率達到了98%，而且分化不定芽長(cháng)勢好。試驗過(guò)程中的觀(guān)察還發(fā)現，在這一培養基上分化培養10 d左右愈傷組織顆粒即可分化出可見(jiàn)的淺綠色芽點(diǎn)，隨后，伴隨著(zhù)愈傷組織顆粒的不斷分化增加和分化不定芽的生長(cháng)，先分化的不定芽基部又會(huì )分化出數量不等的不定芽，形成了綠色的叢生不定芽。分化培養到45 d時(shí)，每個(gè)愈傷組織顆粒就會(huì )分化形成為有3～9個(gè)不定芽組成的叢生不定芽。
    
　　把上述分化培養的綠色不定芽從基部剪下，接種到相同的培養基上進(jìn)行不定芽的分化培養。經(jīng)過(guò)3次重復試驗，每次重復試驗繼代5代的研究證明：不定芽經(jīng)過(guò)40 d培養，平均每個(gè)培養的不定芽可再分化生長(cháng)出高0.5 cm以上不定芽5.4個(gè)。觀(guān)察還表明，經(jīng)過(guò)40 d的培養，所培養的不定芽都分化生長(cháng)為叢生狀，并且分化的不定芽葉片伸展、莖較粗壯、生長(cháng)旺盛。
    
　　上述說(shuō)明，MS+ AgNO31.5 mg•L-1+BA0.8 mg•L-1+NAA0.2 mg•L-1這一培養基是白蘚嫩莖顆粒狀愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基。表2  不同激素愈傷組織分化的影響（略）
　　3.3  不同濃度IAA對不定芽生根的影響試驗觀(guān)察表明，不定芽接種培養8 d時(shí)，有的培養基上開(kāi)始出現根原基。培養到25 d時(shí)觀(guān)察統計的3次重復試驗的平均結果證明：在附加濃度為0.4 mg•L-1，0.6 mg•L-1的IAA培養基上，不僅平均生根率達到了96.5%和97%，平均每株生根數為6.1條，而且生根試管苗長(cháng)勢旺盛。觀(guān)察還表明，不定芽接種到上述兩種培養基上10 d時(shí)，培養材料幾乎都形成了根原基，隨后伴隨著(zhù)根的伸長(cháng)生長(cháng)，試管苗也迅速生長(cháng)。培養到25d時(shí)，就可以生長(cháng)成為高4～5 cm左右、葉片伸展、莖粗壯、根系發(fā)達的旺盛試管苗。把生根試管苗剪成長(cháng)1cm左右、至少具有兩個(gè)腋芽或頂芽的莖段，接種到相同的培養基上進(jìn)行生根繼代培養。經(jīng)過(guò)25 d的培養，又可以培養成1代旺盛的試管苗。經(jīng)過(guò)3次重復試驗，每次重復實(shí)驗6代的繼代培養研究證明，用這種生根繼代培養的方法進(jìn)行繁殖，不僅培養材料的生根率近100%、25 d的繁殖系數為3.1，而且幾乎沒(méi)有無(wú)效苗，繁殖試管苗生長(cháng)非常旺盛。上述結果說(shuō)明，1/3MS+IAA 0.4～0.6 mg•L-1這一培養基是白鮮不定芽生根培養和試管苗生根繼代培養的理想培養基。
　　3.4  試管苗的移栽、扦插和移植移栽后10 d可見(jiàn)成活生長(cháng)，25 d時(shí)觀(guān)察統計證明，以河沙和爐灰渣為移栽基質(zhì)平均成活率分別為95%，97.4%，移栽成活后15 d左右開(kāi)始正常生長(cháng)。
    
　　扦插后15 d可見(jiàn)成活生長(cháng)，30 d時(shí)觀(guān)察統計證明，以爐灰渣為扦插基質(zhì)，成活率為91%。扦插苗前50 d植株較小，后期長(cháng)勢與移栽苗一致。上述說(shuō)明，爐灰渣是白鮮試管苗移栽和扦插的理想基質(zhì)。
    
　　把在日光溫室中移栽、扦插成活的試管苗于五月中旬和下旬先后兩次移植到山坡上，移植的白蘚試管苗保持了野生白蘚的所有生物學(xué)性狀，但與當年的白蘚實(shí)生苗相比，試管苗移植后的前70d生長(cháng)較慢、植株較小，后期葉色濃綠、生長(cháng)非常旺盛而整齊，根系發(fā)達（相當于實(shí)生苗的1.5～2倍），移植苗當年可正常開(kāi)花結實(shí)。
　　4  討論
    本研究以無(wú)生長(cháng)點(diǎn)嫩莖為材料建立起白蘚的無(wú)性系。這說(shuō)明白蘚的非分生細胞和組織也具有全能性。
    用愈傷組織的繼代培養的方法進(jìn)行繁殖，45 d的增殖系數為28.5。按照這個(gè)速度計算，每年的繁殖數量為28.58個(gè)；用不定芽分化繼代的方法進(jìn)行繁殖，平均40 d能培養5.4個(gè)不定芽。按照這個(gè)速度計算，每年的繁殖數量為5.49個(gè)；用生根繼代的方法進(jìn)行繁殖，25 d的繁殖系數為3.1。按照這個(gè)速度計算，每年的繁殖數量為3.114.6個(gè)。上述計算結果證明：無(wú)論采用上述哪種方法進(jìn)行繁殖，每年都能繁殖出大量的試管苗，滿(mǎn)足人們生產(chǎn)對大量種苗的需要，但由于采用生根繼代的方法繁殖的試管苗生長(cháng)旺盛、沒(méi)有無(wú)效苗。所以，生產(chǎn)上應采用生根繼代的方法繁殖白蘚試管苗。
    現在許多研究指出，通過(guò)繼代培養的愈傷組織分化的試管苗容易發(fā)生變異［11～12］，但在本研究中由白蘚無(wú)生長(cháng)點(diǎn)嫩莖愈傷組織誘導培養的的試管苗不僅保持了白蘚的所有生物性狀，并且試管苗長(cháng)勢旺盛而整齊。這可能是由以下原因引起的：一是本研究的環(huán)境較為穩定，不易使培養材料發(fā)生變異；二是白蘚本身具有穩定的遺傳性，不易受到培養環(huán)境的影響發(fā)生變異。這說(shuō)明通過(guò)白蘚嫩莖誘導的愈傷組織建立的無(wú)性系能夠對其進(jìn)行種質(zhì)保存。
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