論文摘要:植物組織培養過(guò)程中,褐變問(wèn)題普遍存在,與菌類(lèi)污染和玻璃話(huà)現象并稱(chēng)為植物組織培養的三大難題。針對褐變難題,本文結合相關(guān)資料,對影響褐變的因素作了全面分析,褐變的影響因素是復雜的,隨植物種類(lèi)外植體的部位幾生理狀況培養基及培養條件的不同而危害的程度有所不同,對這些因素是內因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應的解決措施。
在許多植物組織培養過(guò)程中,常遇到褐變問(wèn)題。褐變主要發(fā)生在外植體,在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質(zhì)體的分離與培養中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐,而且對許多酶有抑制作用,從而影響培養材料的生長(cháng)與分化,嚴重時(shí)甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防范措施,對我們進(jìn)行科學(xué)研究或工廠(chǎng)生產(chǎn),包括植物組織的培養,原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著(zhù)十分重要的現實(shí)意義。
1褐變原因及危害
褐變是指外植體在培養過(guò)程中,自身組織從表面培養基釋放褐色物質(zhì),以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現象。褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類(lèi)化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。很多植物,尤其是木本植物都含有較高的酚類(lèi)化合物,這些酚類(lèi)化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在,因而比較穩定。在切割外植體時(shí),切口附近的細胞受到傷害,其分割狀態(tài)被打破,酚類(lèi)化合物外溢。對于外植體本身來(lái)講,酚類(lèi)物質(zhì)從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應,可誘導植保素或無(wú)物理屏障的形成,以防止微生物侵染組織。但酚類(lèi)很不穩定,在溢出過(guò)程中與多酚氧化酶接觸,在多酚氧化酶的催化下,迅速氧化成褐色的醌類(lèi)物質(zhì)和水,醌類(lèi)物質(zhì)又會(huì )在酪氨酸酶等的作用下,與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合,進(jìn)一步引起其他酶系統失活。從而導致組織代謝活動(dòng)紊亂,生長(cháng)停滯,最終衰老死亡。此外,由于組織的老化病變也會(huì )使多酚氧化酶激活而引起褐變。
2 褐變產(chǎn)生的機理
2.1 非酶促褐變
非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡,即壞死形成的褐變現象,并不涉及酚類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等[1]將生長(cháng)正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中,組織周?chē)绕涫墙佑|培養基部分發(fā)生褐變,但培養基中沒(méi)有看到擴散的褐化物質(zhì)。當溫度升高時(shí)繼代保存時(shí)間過(guò)長(cháng),也會(huì )發(fā)生此類(lèi)現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了[3]。
2.2 酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的,培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類(lèi)化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應,其發(fā)生必須具備三個(gè)條件,即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過(guò)程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來(lái)看,表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類(lèi)化合物,按其組成可分成3類(lèi):苯基羧酸(包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒(méi)食子酸、莽草酸等),苯丙烷衍生物(包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等),第三類(lèi)是黃烷衍生物(包括花青素、黃酮、蕓香苷等),但并非所有的酚類(lèi)物質(zhì)都是PPO的底物。
在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時(shí)存在并不發(fā)生褐變,是因為在正常的組織細胞內由于多酚類(lèi)物質(zhì)分布在細胞的液泡內,而PPO則分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)中,這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發(fā)生變化和破壞時(shí),則為酶創(chuàng )造了與PPO接觸的條件,在氧存在的情況下使酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌,進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應,最后形成黑褐色物質(zhì),從而引起褐變。
3 褐變產(chǎn)生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是復雜的,因植物的種類(lèi)、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同,褐變的程度也有所不同。
3.1植物種類(lèi)及基因型 不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中,品種褐化難易可能是與該品種中多酚類(lèi)物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關(guān)。
3.2 外植體部位及生理狀態(tài) 外植體的部位及生理狀態(tài)不同其褐化程度不同,同時(shí),不同時(shí)期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
3.3 培養基成分 培養基成分中的無(wú)機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外,其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。
3.4 培養條件 溫度過(guò)高或光照過(guò)強,均可加速被培養組織的褐變。不利環(huán)境條件都能造成細胞的程序化死亡,溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
4 防止外植體產(chǎn)生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過(guò)以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧;二是捕捉或減少聚合反應的中間產(chǎn)物;三是抑制有關(guān)的酶。實(shí)際操作上,下列措施是被認為行之有效的。
4.1 適當外植體的選擇
取材時(shí)應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害,夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長(cháng),宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無(wú)菌苗不同組織的誘導試驗表明,莖最容易誘導出愈傷組織,培養2周后長(cháng)出淺黃色的愈傷組織;葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變;而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織,誘導出的愈傷組織全部褐變。
4.2 對外植體的處理
通過(guò)對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類(lèi)物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下:外植體經(jīng)流水沖洗后,在2-5℃的低溫下處理12-24小時(shí),再用升汞或70%酒精消毒,然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天,使組織中的酚類(lèi)物質(zhì)部分滲入培養基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘,再接種到合適的培養基中。若仍有酚類(lèi)物質(zhì)滲出,3-5天后再轉移培養基2-3次,當外植體的切口愈合后,酚類(lèi)物質(zhì)減少,這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體,能減輕外植體褐變,從而提高芽叢誘導率。
4.3 適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關(guān),要考慮所選培養基的狀態(tài)和類(lèi)型。
4.3.1 適當的無(wú)機鹽濃度 張妙霞等[7]在柿樹(shù)組織培養防止褐變所進(jìn)行的試驗中,4種培養基的無(wú)機鹽以改良MS(大量元素減半) 和1/2MS的效果最好,MS的效果較差,結果證明低濃度的無(wú)機鹽可促進(jìn)外植體的生長(cháng)與分化,減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明,隨NaCl濃度升高,褐變現象加重。
4.3.2 適當和適量的激素 王異星[5]在荔枝的組織培養過(guò)程中,培養基中添加1 mg/L BA + 0.5mg/L 2,4-D時(shí),愈傷組織較堅硬,增殖緩慢,易產(chǎn)生褐變。培養基中添加1mg/L BA+1mg/L 2,4-D 時(shí),愈傷組織淺黃疏松,增殖也快。
4.3.3 培養基的硬度 在一定范圍內,瓊脂用量大,培養基硬度大,褐變率低[8],這可能是培養基的硬度影響了酚類(lèi)物質(zhì)的擴散速度的緣故。
4.3.4 培養基中水的硬度的影響 硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來(lái)水,褐變嚴重,甚至會(huì )出現褐變死亡[8]。這可能是配制培養基的水改變了培養基中無(wú)機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
4.3.5 培養基的pH值 在水稻體細胞培養中,pH值為4.5-5.0 時(shí)MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長(cháng)狀態(tài),其表面呈黃白色,而pH值為5.5-6.0時(shí),愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來(lái)說(shuō),酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過(guò)程的發(fā)生[10]。
4.3.6 培養條件 如溫度過(guò)高或光照過(guò)強,光照會(huì )提高PPO的活性,促進(jìn)多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化,從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會(huì )促進(jìn)褐變,其原因是環(huán)境中的CO2向細胞內擴散,細胞內CO32-增多,CO32-與細胞膜上的CO32-結合,使有效CO32-減少,導致內膜系統瓦解,酚類(lèi)物質(zhì)與PPO相互接觸,產(chǎn)生褐變[11]。因此,初期培養要在黑暗或弱光下進(jìn)行。
4.4 添加褐變抑制劑和吸附劑
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用,使其重新還原為酚[12]。由于其作用過(guò)程均為消耗性的,在實(shí)際應用中應注意添加量,其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無(wú)毒副作用,在生產(chǎn)應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中,添加植酸(PA),可防止褐變,PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用,使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 +結合,從而降低了其活力。陳學(xué)森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實(shí)了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP);钚蕴渴且环N吸附性較強的無(wú)機吸附劑,能吸附培養基中的有害物質(zhì),包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養物在培養過(guò)程中分泌的酚、醌類(lèi)物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等, 從而有利于培養物的生長(cháng)。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強,一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過(guò)程中應注意,盡量用最低濃度的活性炭來(lái)對抗褐變的產(chǎn)生,因為活性炭的吸附作用是沒(méi)有選擇性的,在吸附物質(zhì)的同時(shí),也會(huì )吸附培養基中的其他成分,對外植體的誘導分化會(huì )產(chǎn)生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類(lèi)物質(zhì)的專(zhuān)一性吸附劑,在生化制備中常用作酚類(lèi)物質(zhì)和細胞器的保護劑,可用于防止褐變[15]。
4.5 進(jìn)行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過(guò)程中,經(jīng)常進(jìn)行細胞篩選,可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉移到新鮮培養基中,能減輕酚類(lèi)物質(zhì)對培養物的毒害作用,降低抑制作用,使外植體盡快分生,連續轉移5-6次,可基本解決外植體的褐變問(wèn)題。
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