細菌波動(dòng)生長(cháng)過(guò)程中代謝活性與環(huán)境變化的統一性研究

摘　要　目的：闡明波動(dòng)條件下細菌自身代謝與周?chē)�環(huán)境變化的關(guān)系。方法：通過(guò)Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量，鄰甲苯胺法檢測葡萄糖含量，聚鄰苯二胺pH修飾電極檢測pH值來(lái)觀(guān)察環(huán)境條件的變化；以顯色法檢測波動(dòng)環(huán)境內、外細菌的TTC-脫氫酶活性。結果：細菌群體在靠近中央位置形成封閉環(huán)境，在遠離中央位置出現濃度梯度現象。伴隨著(zhù)封閉環(huán)境的形成，細菌代謝近乎停止；伴隨著(zhù)濃度梯度的出現，細菌代謝趨于旺盛。結論：細菌的波狀生長(cháng)是生物耗散與生態(tài)環(huán)境相統一的具體表現。
　　關(guān)鍵詞：波動(dòng)生長(cháng)；細菌代謝；環(huán)境變化
　　細菌的生長(cháng)代謝是開(kāi)放系統條件下的生命活動(dòng)過(guò)程，它一方面導致著(zhù)周?chē)�環(huán)境條件的變化，另一方面又受到環(huán)境條件變化的制約。許多學(xué)者把環(huán)境因素納入了微生物學(xué)研究的范疇，運用環(huán)境條件變化與細菌生長(cháng)代謝改變的關(guān)系來(lái)預測菌群間相互作用的結果^［1］、食品中細菌的生長(cháng)狀況^［2］并建立預測模型^［3］。不同環(huán)境條件下細菌的生長(cháng)方式及生理狀態(tài)都有所不同，這在細菌生長(cháng)的群體、周期和波動(dòng)變化中可得以體現^［4］。目前，對細菌波動(dòng)生長(cháng)過(guò)程的研究主要集中在對細自身變化的探討上，對環(huán)境因素變化與細菌自身變化的關(guān)系研究得較少。研究細菌波動(dòng)過(guò)程中環(huán)境因素的菌變化及細菌代謝活性的變化，有助于對細菌波動(dòng)發(fā)生機制的解釋。
　　本實(shí)驗以變形桿菌波動(dòng)模型為研究對象，定量檢測了波動(dòng)模型形成過(guò)程中不同波動(dòng)環(huán)中的營(yíng)養物質(zhì)含量，酸堿堆積情況及細菌代謝活性，以期為細菌波動(dòng)的發(fā)生機制提供環(huán)境因素及細菌代謝方面的實(shí)驗依據。
　　1　材料與方法
　　1.1　菌種
　　奇異變形桿菌(P.mirabilis)，由生物波研究中心保存。
　　1.2　波動(dòng)培養基
　　按照劉俊康等^［5］報道的方法制備。
　　1.3　聚鄰苯二胺pH修飾電極
　　由本�；瘜W(xué)教研室提供。
　　1.4　細菌波動(dòng)生長(cháng)過(guò)程中各環(huán)蛋白質(zhì)及葡萄糖含量的測定
　　每次用5塊波動(dòng)Ⅰ號平板，重復4次。每塊平板中心點(diǎn)種奇異變形桿菌，37°C培養24h后，細菌波狀生長(cháng)形成5個(gè)紅環(huán)，5個(gè)黃環(huán)，在按紅黃環(huán)區域在平皿背面做好標記后，用無(wú)菌生理鹽水洗去平板表面菌體并晾干。從中央紅環(huán)開(kāi)始，依次向外紅黃相間的每環(huán)取0.3g培養基成分，取相同培養條件下放置24h未點(diǎn)種細菌的波動(dòng)Ⅰ號平板中的0.3g培養基成分作為標準對照。將0.3g培養基加熱溶于3ml蒸餾水中，各取0.1ml按Lowry法及鄰甲苯胺法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量及葡萄糖含量的測定。
　　1.5　細菌波動(dòng)生長(cháng)過(guò)程中不同區域pH值測定
　　同上法波動(dòng)培養24h后，自中心環(huán)向外，每環(huán)取3點(diǎn)，用聚鄰苯二胺pH修飾電極測定各環(huán)的pH。
　　1.6　TTC-脫氫酶標準曲線(xiàn)的制作
　　按牛志卿等^［6］提供的方法，用直線(xiàn)回歸方程表示。
　　1.7　細菌波動(dòng)過(guò)程中各環(huán)TTC-脫氫酶活性的測定
　　同上法波動(dòng)培養24h后，每環(huán)取定量細菌振蕩混勻于5ml蒸餾水中，然后用5ml三氯甲烷進(jìn)行萃取，其余步驟同標準曲線(xiàn)制作。
　　1.8　各環(huán)細菌波動(dòng)環(huán)境外的TTC-脫氫酶活性測定
　　用未加氯化三苯基四氮唑(TTC)的波動(dòng)Ⅰ號培養基同上法波動(dòng)培養24h后，每環(huán)取定量細菌配成1ml菌液，各加入Tris-HCl緩沖液2ml和TTC-葡萄糖標準溶液2ml，置于(37±1)°C恒溫培養箱中，反應4h顯色后，其余步驟同標準曲線(xiàn)制作。
　　1.9　統計學(xué)處理
　　實(shí)驗數據均以 表示，采用本校數理統計教研室提供的醫學(xué)統計程序包中單因素方差分析(PDA-2)程序處理分析數據資料。
　　2　結果
　　2.1　細菌波動(dòng)生長(cháng)過(guò)程中各環(huán)蛋白質(zhì)含量、葡萄糖含量、pH值及兩兩間差異的檢驗
　　結果見(jiàn)表1，波動(dòng)的前6環(huán)之間數值比較接近，后4環(huán)出現較大變化，經(jīng)Newman-Keuls法對各組數據進(jìn)行了多重比較，結果顯示，在α=0.05水平下，蛋白質(zhì)含量、葡萄糖含量及pH值在細菌波動(dòng)的前6環(huán)之間差異均不顯著(zhù)，在后4環(huán)之間及后4環(huán)與前6環(huán)之間差異均顯著(zhù)。

表1　各波動(dòng)環(huán)中蛋白質(zhì)、葡萄糖含量及pH值( )
　　tab1　Protein,glucose content and pH of different bacterial wave loop( )

　　2.2　細菌波動(dòng)過(guò)程中各細菌環(huán)的TTC-脫氫酶活性
　　結果見(jiàn)表2。經(jīng)Newman-Keuls法對同一環(huán)不同時(shí)間TTC-脫氫酶催化反應的TTC量進(jìn)行兩兩間比較，結果顯示，在α=0.05的水平下，前6環(huán)在不同時(shí)間的TTC消耗量差異不顯著(zhù)，后4環(huán)在不同時(shí)間的TTC消耗量差異顯著(zhù)。 表2　不同波動(dòng)環(huán)中的細菌TTC-脫氫酶活性(mg, )
　　tab2　Bacterial TTC-dehyogenase activity in different wave loop(mg, )

*:P＜0.05 vs 1 h;△:P＜0.05 vs 2 h
　　2.3　波動(dòng)環(huán)境外各環(huán)細菌的TTC-脫氫酶活性
　　結果見(jiàn)表3。用Newman-Keuls法對數據進(jìn)行了兩兩比較，在α=0.05的水平下，兩兩間差異均不顯著(zhù)。
表3　波動(dòng)環(huán)境外各環(huán)細菌的TTC-脫氫酶活性(mg, )
　　tab3　Bacterial TTC-dehyogenase activity in different wave loop outside of the wave environment(mg, )

　　3　討論　　細菌的生命活動(dòng)在不同的環(huán)境條件下發(fā)生潛-生序適應性變化，宏觀(guān)上表現為不同的生長(cháng)方式，Rascle等^［7］建立了細菌的趨化性生長(cháng)模型，徐啟旺等^［4］也建立了細菌波動(dòng)生長(cháng)模型并揭示出細菌的波狀生長(cháng)方式可能是一種普遍現象。實(shí)驗研究已經(jīng)發(fā)現細菌在波狀生長(cháng)過(guò)程中會(huì )發(fā)生短桿菌與長(cháng)條菌之間的潛-生序交替變化，兩者在細胞結構及抵抗力方面存在著(zhù)一些差別^［8］，這些都初步提示細菌在潛-生序微觀(guān)變化基礎上產(chǎn)生的宏觀(guān)波動(dòng)可能是細菌的一種自我保護和生存機制，本實(shí)驗選取培養基中蛋白質(zhì)和葡萄糖含量作為衡量環(huán)境營(yíng)養狀況的指標，以pH值作為衡量環(huán)境酸堿堆積情況的指標，通過(guò)測定細菌的TTC-脫氫酶活性來(lái)反映細菌的代謝活性，將這些指標相結合，有助于精細分析周?chē)�環(huán)境壓力與細菌自身變化間的相互作用。
　　表1的實(shí)驗結果顯示，隨著(zhù)細菌由中心向外波動(dòng)的延伸，培養基中營(yíng)養物質(zhì)的消耗情況和酸堿物質(zhì)的堆積情況在前6環(huán)中基本上是形成了一個(gè)平臺，在最后4環(huán)中才逐漸形成了一個(gè)減少或增加的梯度。經(jīng)單因素方差分析結果顯示，前6環(huán)中各環(huán)之間營(yíng)養物質(zhì)含量及環(huán)境pH值差異不顯著(zhù)，后4環(huán)之間的差異及各環(huán)與標準對照之間的差異均顯著(zhù)(P＜0.05)。從實(shí)驗結果中可看出，前6環(huán)中營(yíng)養物質(zhì)含量甚少，且相互間無(wú)顯著(zhù)差異，表明這6環(huán)中已幾乎形成了一個(gè)封閉環(huán)境，如果將這個(gè)封閉環(huán)境中的所有細菌都移去，細菌波動(dòng)仍然能夠繼續延伸，這表明封閉環(huán)境內由于營(yíng)養物質(zhì)的耗散，細菌生命活動(dòng)極度減弱，對細菌波動(dòng)的延續已不起主導作用；而后4環(huán)中環(huán)境的營(yíng)養物質(zhì)還存在一定的梯度，即還存在著(zhù)一個(gè)非平衡環(huán)境，因此當封閉環(huán)境中的細菌移去后，由于非平衡動(dòng)力的存在，細菌波動(dòng)仍然能夠延續下去。
　　為了進(jìn)一步觀(guān)察封閉環(huán)境及非平衡環(huán)境對細菌生命活動(dòng)的影響，我們還測定了各環(huán)中細菌的TTC-脫氫酶活性及各環(huán)細菌移出各自的波動(dòng)環(huán)境后的TTC-脫氫酶活性，從第9環(huán)(即第5個(gè)紅環(huán))初步形成開(kāi)始到第9環(huán)完全形成的3h中，每隔1h測定一次各環(huán)細菌的TTC-脫氫酶活性，結果顯示第5環(huán)以前的各環(huán)細菌TTC-脫氫酶活性幾乎沒(méi)變化，而第6環(huán)以后的細菌TTC-脫氫酶活性均逐漸有所增加。但我們把中心環(huán)直至最外環(huán)的細菌均定量取到試管中測定它們各自的TTC-脫氫酶活性時(shí)，結果則顯示各環(huán)間相差不顯著(zhù)(P＞0.05)。這些都強烈地提示在細菌波動(dòng)過(guò)程中，一旦形成了封閉環(huán)境，細菌生長(cháng)便近乎停止，留下來(lái)的是生命活動(dòng)的載體和殘跡，當進(jìn)入一個(gè)開(kāi)放系統后，波動(dòng)又沿著(zhù)單一方向進(jìn)行下去。
　　細菌波動(dòng)是生物波的一個(gè)簡(jiǎn)單模型，本實(shí)驗結合一些先前研究結果從一個(gè)方面提示，細菌波動(dòng)過(guò)程是一個(gè)生物耗散與生態(tài)環(huán)境相統一的過(guò)程。而兩者的因果關(guān)系及細菌波動(dòng)生長(cháng)過(guò)程的調控機制，尚有待進(jìn)一步的研究。
　　　　參考文獻
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