臨床微生物實(shí)驗室細菌鑒定指南（上）

一．細菌的鑒定步驟

1． 鑒定的概念：將一個(gè)未知的菌株按其生物學(xué)特性，經(jīng)過(guò)與所有已知菌種進(jìn)行比較后劃歸到一個(gè)已知菌種的分析過(guò)程。

2． 對待鑒定的菌種要明確已經(jīng)獲得純化培養或者該菌種在血平板上生長(cháng)良好，有單個(gè)菌落可以進(jìn)行生化試驗。（我們這里一般都是預先純化培養）

3． 對待鑒定的菌種進(jìn)行革蘭染色，觀(guān)察形態(tài)（G⁺c，G^–b，G^–c，G⁺b），做觸酶，氧化酶實(shí)驗，然后按科，屬，種逐步鑒定。要注意對待鑒定的菌種選擇一個(gè)合適的鑒定系統，臨床常見(jiàn)細菌的快速簡(jiǎn)單的鑒定系統我們都已經(jīng)設計好，參考鑒定質(zhì)控單。

4． 按鑒定質(zhì)控單的要求填寫(xiě)好病人姓名，年齡，性別；標本類(lèi)型，標本編號，送檢日期等。另外最重要的是要填寫(xiě)好該菌種的菌落形態(tài)以及有無(wú)溶血。

5． 復習革蘭染色，觸酶實(shí)驗，氧化酶實(shí)驗。

⑴．革蘭染色：是細菌鑒定過(guò)程中最常用最基本最重要的染色方法。

首先要將待鑒定的細菌涂片，固定（目的：殺死細菌，改變細菌對染料的通透性）。

第一步：以結晶紫初染（染色液Ⅰ）

第二步：以盧戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）

第三步：用95%乙醇脫色（染色液Ⅲ）

第四步：最后用稀釋復紅復染（染色液Ⅳ）

⑵．觸酶實(shí)驗(H₂O₂實(shí)驗)：

a.原理：具有過(guò)氧化氫酶的細菌能催化雙氧水生成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現氣泡。

b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在潔凈的玻片上涂開(kāi)，滴加3%過(guò)氧化氫數滴，觀(guān)察結果（立即有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性）。要注意不能在血平板上進(jìn)行實(shí)驗，這樣易出現假陽(yáng)性；另外陳舊菌落要是進(jìn)行實(shí)驗可能會(huì )導致假陰性結果；還有不能在接種針或環(huán)上進(jìn)行實(shí)驗。

c.陽(yáng)性對照用金黃色葡萄球菌，陰性對照用鏈球菌；試劑要避光置4℃冰箱保存。

d.應用：絕大多數含細胞色素的需氧和兼性厭氧細菌觸酶實(shí)驗陽(yáng)性，鏈球菌屬陰性。臨床常見(jiàn)細菌鑒定實(shí)驗中我們一般用于區別葡萄球菌屬（+），微球菌屬（+），鏈球菌屬（－）。

⑶．氧化酶實(shí)驗（Kovac實(shí)驗）：

a.       原理：氧化酶又稱(chēng)細胞色素酶，是細胞色素呼吸酶系統的最終呼吸酶。酶并不直接與試劑（1%鹽酸四甲基對苯二胺）起反應，而是首先使細胞色素c氧化，然后氧化型細胞色素c使對苯二胺氧化，出現深蘭色反應。

b.       方法（濾紙法，菌落法，試劑紙片法）：

一般我們采用濾紙法，取白色潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加試劑一滴，陽(yáng)性者立即呈粉紅色，繼而出現深蘭色。結果讀取在10秒鐘時(shí)為最佳，60秒內讀取可靠。本實(shí)驗避免接觸含鐵物質(zhì)（假陽(yáng)性），也不能在含糖培養基上生長(cháng)的菌落進(jìn)行實(shí)驗（假陰性）。

c.       陽(yáng)性對照用銅綠假單胞菌，陰性對照用大腸埃希菌。

d.       應用：奈瑟氏屬的菌種均陽(yáng)性，也用于區別假單胞菌屬和腸桿菌，前者陽(yáng)性，后者陰性。

 二．葡萄球菌屬的鑒定

  葡萄球菌屬主要的種有金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。

1． 形態(tài)與染色：葡萄球菌直徑0.5～1.5μm，菌體圓形，呈單個(gè)，成雙以及不規簇狀排列。染色呈紫色，為革蘭陽(yáng)性球菌。

2． 與鏈球菌的區別：觸酶實(shí)驗為陽(yáng)性，而鏈球菌陰性；菌體形態(tài)鏈球菌小于葡萄球菌，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形的革蘭陽(yáng)性球菌。

3． 與微球菌的區別：觸酶實(shí)驗同為陽(yáng)性，但微球菌的菌體呈四聯(lián)狀，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗（操作方法同甘露醇OF試驗）為氧化型；而葡萄球菌為發(fā)酵型。另外呋喃唑酮（即痢特靈50μg/片）敏感實(shí)驗微球菌為耐藥，而金黃色葡萄球菌為敏感。

4． 葡萄球菌屬的種間鑒定：

⑴．菌落色素與溶血毒素：金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色，檸檬色或者淡黃色，而其他葡萄球菌則在血平板上菌落大多數為白色，也有部分為檸檬色或深黃色。

⑵．溶血毒素：金黃色葡萄球菌有α﹑β﹑γ﹑δ溶血毒素，各毒素的區別是對動(dòng)物紅細胞的溶血范圍﹑抗原性及溶血時(shí)的溫度等。其中以α溶血毒素為主。而其他葡萄球菌大多數不產(chǎn)生溶血毒素，只有表葡有極少能產(chǎn)生溶血毒素。

⑶．血漿凝固酶實(shí)驗：用與區別金黃色葡萄球菌（陽(yáng)性），表皮葡萄球菌（陰性），腐生葡萄球菌（陰性）。血漿凝固酶是金葡菌所產(chǎn)生的，有結合凝固酶和游離凝固酶兩種。血漿凝固酶檢測有兩種方法，為玻片法和試管法，我們一般采用玻片法。

a. 操作方法：挑取少許金黃色葡萄球菌菌落在玻片上與血漿乳化，結合凝固酶能作用于血漿中的纖維蛋白原，從而在金黃色葡萄球菌表面發(fā)生凝集，所以我們肉眼能看見(jiàn)凝集顆粒。玻片法主要由結合凝固酶作用產(chǎn)生；游離凝固酶是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的胞外酶，能與血漿中的血漿凝固反應因子（類(lèi)似凝血酶的一種物質(zhì)）作用，形成復合物再使纖維蛋白原轉化成纖維蛋白而發(fā)生凝集。試管法主要由游離凝固酶作用產(chǎn)生。

b. 注意事項：菌落不能太多，否則會(huì )影響結果觀(guān)察；凝固酶陽(yáng)性要做自凝陰性對照（用生理鹽水代替血漿），只有在陰性對照也不凝集才能認為是真正的陽(yáng)性，有一部分葡萄球菌有自凝現象。

⑷．新生霉素敏感實(shí)驗：金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌對新生霉素紙片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌則對之耐藥。抑菌環(huán)直徑>16mm即為新生霉素敏感。

⑸．甘露醇氧化發(fā)酵實(shí)驗：

a.操作方法：取兩支甘露醇微量生化管，在微量管內接種待檢細菌，然后一支加兩滴石臘密封，另外一支則不加，放37℃孵箱內18～24h后觀(guān)察結果。

b.結果觀(guān)察：微量生化管變黃色為陽(yáng)性，也就是能利用甘露醇。若兩管都變黃色則說(shuō)明是發(fā)酵型；其中加石蠟管不變色，沒(méi)加石蠟管變黃色則為氧化型；如果兩管都不變色則說(shuō)明該細菌是不利用甘露醇（產(chǎn)堿型）。

c.應用：金黃色葡萄球菌在需氧和厭氧的條件下都能利用甘露醇（即兩管都變黃色）；表皮葡萄球菌需氧部分產(chǎn)酸，厭氧條件下不利用甘露醇（即沒(méi)加石蠟管有部分會(huì )變黃色，加石蠟管不變黃色）；腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌類(lèi)似。

 三．微球菌屬的種間鑒定

微球菌屬主要的種有易變微球菌，藤黃微球菌，玫瑰微球菌。鑒定生化見(jiàn)下表

       d：不定     S：敏感     R：耐藥

 四．鏈球菌屬

1． 形態(tài)和染色：鏈球菌的直徑為0.5～1.0μm，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形革蘭陽(yáng)性球菌，菌體小于葡萄球菌，無(wú)鞭毛，沒(méi)有芽胞，但有些菌株會(huì )形成莢膜。肺炎鏈球菌呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外。

2． 根據鏈球菌在血平板上溶血現象的不同分為三種：⑴甲型（α-）溶血，即菌落周?chē)�出現較窄的草綠色溶血環(huán)；⑵乙型（β-）溶血，即菌落周?chē)�出現較寬的透明溶血環(huán)；⑶丙型（γ-）溶血，即菌落周?chē)鸁o(wú)溶血環(huán)。

3． 根據抗原結構（C多糖抗原）的不同可分為A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T等18個(gè)群，對人類(lèi)有致病者90%屬于A群，偶見(jiàn)其他群鏈球菌致病。

4． 鏈球菌屬的種間鑒定

⑴．乙型溶血鏈球菌的鑒定：

a． 對桿菌肽（0.04U/片）（抑菌圈直徑≥10mm）敏感：A群鏈球菌（主要為化膿性鏈球菌）。

b． 對桿菌肽不敏感，膽汁七葉苷實(shí)驗陰性，但馬尿酸鈉水解實(shí)驗﹑CAMP實(shí)驗陽(yáng)性：B群鏈球菌（主要為無(wú)乳鏈球菌）。

c． 對桿菌肽不敏感，膽汁七葉苷實(shí)驗陰性，馬尿酸鈉水解實(shí)驗陰性，CAMP實(shí)驗陰性：主要為馬鏈球菌﹑類(lèi)馬鏈球菌﹑獸疫鏈球菌；對三者的區別實(shí)驗要加做海藻糖和山梨醇實(shí)驗。

d． CAMP實(shí)驗：將能產(chǎn)生β-溶血的金黃色葡萄球菌在血平板上劃一橫線(xiàn)接種，再將待鑒定菌于金黃色葡萄球菌3mm處垂直種一短線(xiàn)，若在有CO₂條件下培養5～6小時(shí)，或無(wú)CO₂條件下培養18～24小時(shí)，在兩細菌連接處出現一個(gè)半月型的加強溶血區即為CAMP實(shí)驗陽(yáng)性。

⑵．甲型溶血鏈球菌的鑒定：

a． 草綠色鏈球菌：對桿菌肽敏感，對奧普托欣（Optochin）不敏感，膽汁溶菌實(shí)驗陰性，膽汁七葉苷實(shí)驗陰性，在高鹽中不生長(cháng)。主要有變異鏈球菌，輕型鏈球菌，血鏈球菌，唾液鏈球菌等。

b． 肺炎鏈球菌：菌體呈矛頭狀，成雙排列，鈍端相對，尖端相背，較葡萄球菌，其他鏈球菌略大；在血平板上菌落細小﹑圓形﹑表面光滑﹑灰白色﹑半透明，開(kāi)始時(shí)菌落呈扁平狀，以后中心塌陷，呈臍窩狀。與草綠色鏈球菌的主要區別是膽汁溶菌實(shí)驗陽(yáng)性，對奧普托欣（Optochin）敏感。奧普托欣（Optochin）含量為5μg/片，抑菌環(huán)>18mm為敏感，<15mm為不敏感，15～18mm應重復實(shí)驗。

⑶．腸球菌（D群鏈球菌）的鑒定：

溶血不定，主要是α-﹑γ-溶血；對桿菌肽不敏感，但其特異性實(shí)驗是膽汁七葉苷實(shí)驗陽(yáng)性；若能在6.5%NaCl的心浸液肉湯中生長(cháng)即為D群腸球菌，不能生長(cháng)為D群非腸球菌。

⑷．鏈球菌屬鑒定的系統生化結果判斷

a． 1%美蘭牛乳

b． 膽汁七葉苷實(shí)驗：變黑為陽(yáng)性。

c． PH9.6肉湯實(shí)驗：變渾濁為能在堿性環(huán)境中生長(cháng)（陽(yáng)性）。

d． 6.5%NaCl心浸液肉湯：由紫變黃為能在高鹽環(huán)境中生長(cháng)（陽(yáng)性）。

e． 精氨酸雙水解酶實(shí)驗：變紅色（對照不變色，仍為黃色）為陽(yáng)性。

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