內生放線(xiàn)菌和寄主植物的抑菌活性及其關(guān)系

【關(guān)鍵詞】  中草藥植物； 內生放線(xiàn)菌； 抑菌活性

    ABSTRACT  This paper reports that total 84 or 36 out of the tested 560 endophytic actinomycetes strains from 68 Chinese medicinal herbs, showed inhibition activity against Staphylococcus aureus or Candida albicans, respectively, suggesting a potential source for novel antibiotics. Further investigation by using water or ethanol extracts of the nine herbs against Staphylococcus aureus, indicated no apparent relationships on inhibition of the pathogen between herbs and their endophytic actinomycetes.

    KEY WORDS  Chinese medicinal herbs;  Endophytic actinomycetes;  Inhibition activity

      目前發(fā)現的放線(xiàn)菌(主要來(lái)自土壤)產(chǎn)生的抗生素和生理活性物質(zhì)超過(guò)10000種，占已發(fā)現微生物藥物的約2/3［1］。近年來(lái)從獨特生境中分離放線(xiàn)菌并尋找新的抗生素已逐漸受到重視，如從植物組織內部中分離其內生放線(xiàn)菌和尋找新抗生素［2］。我國擁有豐富的中草藥植物資源，其中一些中草藥長(cháng)期被用來(lái)清熱解毒、化膿消腫，提示可能存在抗菌活性物質(zhì)。本文報道從68種中草藥植物中分離大量的內生放線(xiàn)菌，其中約15%菌株具有抗金葡菌的活性，約6%菌株對白念珠菌有抑菌活性。此外，初步探討了內生放線(xiàn)菌與其寄主植物在抗菌活性方面可能的對應關(guān)系。

    1  材料與方法

    1.1  中草藥植物和病原菌來(lái)源

    本試驗所用大部分中草藥植物采自上海植物園，丹參和燈盞花采自云南昆明(邱明華研究員提供)，青蒿采自四川酉陽(yáng)(利民青蒿基地提供)，金葡菌由揚州大學(xué)微生物實(shí)驗室金文杰老師提供。

    1.2  培養基、試劑和抗生素

    試驗中分離內生放線(xiàn)菌所用的為S培養基［2］、S培養基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸、S培養基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+鏈霉素、S培養基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+萬(wàn)古霉素等4種培養基(重鉻酸鉀的終濃度為85μmol/L，萘啶酮酸65μmol/L，鏈霉素2μg/ml，萬(wàn)古霉素4μg/ml)，純化和進(jìn)一步培養內生放線(xiàn)菌采用高氏一號培養基［3］。培養金葡菌用LB培養基。

    1.3  植物內生放線(xiàn)菌的分離

    將采摘的新鮮植物用清水洗凈，根、莖、葉各部分分開(kāi)，于陰涼處風(fēng)干。用70%的乙醇、0.87%的次氯酸鈉和10%的碳酸氫鈉分別處理5、20和10min以達到表面消毒，接著(zhù)用無(wú)菌水洗滌三次，再用無(wú)菌濾紙吸干水分。將植物剪成約1cm的小段，置于上述4種分離培養基表面，于30℃培養。樣品表面消毒方法參照文獻［4，5］，分離內生放線(xiàn)菌的方法參照文獻［4］，根據形態(tài)和培養特征初步鑒定放線(xiàn)菌菌株參照文獻［3］，部分放線(xiàn)菌菌株的鑒定采用16S rDNA序列測定和比對。

    1.4  內生放線(xiàn)菌的抑菌試驗

    金葡菌或白念珠菌接種于25ml LB液體，37℃培養過(guò)夜，取10ml菌液與250ml LB混合，澆制成平板。植物內生放線(xiàn)菌菌株接種于高氏一號培養基，于30℃生長(cháng)7d，用打孔器在平板上打孔，接種針挑出放線(xiàn)菌瓊脂菌塊，放置在混合有指示菌的平板上，30℃培養2～3d后觀(guān)察和測量可能的抑菌圈。

    1.5  植物的水或乙醇的提取及提取液的抑菌試驗

    將采摘的新鮮植物用清水洗凈和風(fēng)干，一份稱(chēng)取0.8g，用研磨碾碎后加入3.2ml 70%乙醇，隔一段時(shí)間振蕩一次進(jìn)行萃��；另一份稱(chēng)取0.1g，進(jìn)行表面消毒(方法同上)，然后剪碎并轉移至Eppendorf管，用研磨碾碎后加入0.4ml無(wú)菌水浸泡。將滅菌的圓形濾紙片(4mm)置于混合有指示菌的平板上，加入5μl水或醇提取液于濾紙片上，30℃培養2～3d后進(jìn)行抑菌圈測定。

    2  結果

    2.1中草藥植物的內生放線(xiàn)菌對金葡菌和白念珠菌的抑菌活性

    從上海市植物園、云南昆明和四川酉陽(yáng)等地采集到68種中草藥植物，表面消毒后在4種固體培養基上共分離，并初步鑒定了560株內生放線(xiàn)菌。這些放線(xiàn)菌菌株在高氏一號培養基上經(jīng)劃線(xiàn)純化培養后打下圓形菌塊，置于混合有金葡菌或白念珠菌的平板上以檢測可能的抑菌活性。表1結果顯示，來(lái)自35種中草藥植物的84株內生放線(xiàn)菌對金葡菌具有抑菌活性(抑菌圈直徑在4.5～19mm，詳細數據未列出)，占測試菌株總數的約15%。來(lái)自33種中草藥植物(包括白毛夏枯草、腹水草、萱草、大蔥、小蔥、大蒜、艾蒿、燈盞花、三七、青蒿、移星草、薄荷、三白草、富貴草、九頭獅子草、絞股藍、東風(fēng)菜、玄參、白英、茜草、馬兜鈴、博落回、厚果雞血藤、杜仲、山楂、側柏、苦參、桑樹(shù)、雪松、川楝、三尖杉、日本常山云和南旌節花)的167株內生放線(xiàn)菌未檢測到明顯的抑制金葡菌的活性。 

    除去分離到較少(如<5株)內生放線(xiàn)菌菌株的植物外，分離菌株較多的植物如紫金牛、野蕎麥、毛茛和紫菀等的內生放線(xiàn)菌菌株具有抑菌活性的比例較高，分別為56%、50%、50%和41%，提示具有抑制金葡菌活性的植物內生放線(xiàn)菌的分布可能有偏好性。 

    表1結果顯示，來(lái)自22種中草藥植物中的36株放線(xiàn)菌對于白念珠菌具有抑菌活性(約占測試菌株總數的6%)，其中來(lái)自貫眾、磨芋、敗醬和陸英等的內生放線(xiàn)菌菌株具有抑菌活性的比例較高， 分別為21%、表1 43種中草藥植物中對金葡菌和白念珠菌有抑菌活性的內生放線(xiàn)菌株數 20%、17%和29%。

    2.2  中草藥植物的抽提液對金葡菌的抑菌活性

    為了進(jìn)一步研究?jì)壬�放線(xiàn)菌菌株與其寄主中草藥植物在有或無(wú)抑菌活性方面是否有對應關(guān)系，我們測定了一些植物提取液的抑菌活性。選取內生放線(xiàn)菌菌株具有較高抑菌比例的紫金牛、野蕎麥、毛茛、紫菀和貫眾等5種植物，以及具有較低抑菌比例的陸英、打破碗花花、括樓和澤蘭等4種植物，用水或70%乙醇抽提，檢測對金葡菌的抑菌活性。表2結果表明，雖然紫金牛、毛茛、紫菀和貫眾等4種植物的水或醇提取物具有抑菌活性，但野蕎麥的水或醇提取液中沒(méi)有檢測到抑菌活性；另一方面，雖然括樓的提取液中沒(méi)有抑菌活性，但是陸英、打破碗花花和澤蘭的提取液中卻具有抑菌活性。這些結果顯示，內生放線(xiàn)菌菌株對金葡菌的抑菌活性與其寄主植物沒(méi)有明顯的對應關(guān)系。

    3  討論

    由于植物內生菌來(lái)自獨特的生存環(huán)境而成為人們尋找微生物新藥的一個(gè)重要藥源。在植物內生放線(xiàn)菌產(chǎn)生抗生素方面，有報道從杜鵑花［6］、蛇藤［7］和衛矛科植物［8］分離到的內生放線(xiàn)菌產(chǎn)生了新的抗細菌或真菌的化合物。國內文獻報道了水稻內生放線(xiàn)菌產(chǎn)生抗真菌的活性［9］，三葉草中的內生放線(xiàn)菌有抗細菌活性［10］，西雙版納藥用植物中分離的165株內生放線(xiàn)菌中有70株表現抗多種細菌和真菌活性［11］。在我們的試驗中，發(fā)現68種中草藥植物的560株內生放線(xiàn)菌中表2  9種新鮮中草藥植物的抽提液對金葡菌的抑菌活性有84株(約15%)對金葡菌具有抑制活性，有36株放線(xiàn)菌(約6%)對白念珠菌具有抑菌活性，進(jìn)一步表明中草藥植物內生放線(xiàn)菌可能是篩選抗菌新藥的一個(gè)重要資源。

    1993年Stierle等［12］從短葉紅豆杉中發(fā)現一種可以產(chǎn)紫杉醇的內生真菌，此后還有許多類(lèi)似的報道，導致了一種觀(guān)點(diǎn)：由于植物內生菌與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化，內生菌可以產(chǎn)生與寄主植物相同的物質(zhì)。我們的試驗結果表明，至少對抑制金葡菌的活性而言，內生放線(xiàn)菌菌株的抑菌活性與其寄主植物的沒(méi)有明顯的對應關(guān)系。一種可能的原因是放線(xiàn)菌屬于原核生物，寄主植物為真核生物，兩者之間遺傳物質(zhì)的交換特別是基因表達存在很大障礙；而同屬于真核生物的內生真菌與寄主植物的遺傳物質(zhì)交流和表達的障礙較小。

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