分支桿菌藥物敏感性測定的幾個(gè)問(wèn)題

非結核分支桿菌病的治療和藥物敏感性測定最初是模仿結核病的治療和結核分支桿菌藥敏試驗。但是,非結核分支桿菌在藥物敏感性方面存在一些自己的特征。因此, 與結核分支桿菌藥敏試驗方法有所不同。目前對分支桿菌藥物敏感性研究尚欠深入,對其規律性認識不清， 結果不令人滿(mǎn)意。

　　一、分支桿菌藥物敏感性特征

　　就其對藥物敏感性而言, 非結核分支桿菌存在三個(gè)特點(diǎn):(1)藥物敏感度幅度大,分布散。 結核分支桿菌野生株對利福平、 異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、 氧氟沙星等的最低抑菌濃度（MIC）范圍相差僅 2～4倍,而鳥(niǎo)分支桿菌野生株對上述藥物的MIC范圍則有十數倍至百倍之多。這樣的結果,僅僅是從肺部感染和人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）的播散性感染患者分離株的測定結果。如果包括環(huán)境或無(wú)明顯癥狀者僅僅是棲居的痰中分離株MIC的范圍可能更廣^{［1, 2］}。 和MIC一樣，最低殺菌濃度（MBC）也顯示同樣的特征，幅度大,分布散。 氧氟殺星和環(huán)丙殺星對鳥(niǎo)分支桿菌的MBC/MIC比值在1～8, 而結核分支桿菌僅為0.5～2。一些抑菌和殺菌定量指標分布散的特點(diǎn)，也反映在鳥(niǎo)分支桿菌的瓊脂固體培養基和液體培養基上，測定結果相差遠較結核分支桿菌大。在7H10瓊脂培養基和7H12液體培養基測定的結核分支桿菌對異煙肼、乙硫異煙胺、 利福平、鏈霉素、 卷曲霉素、乙胺丁醇等MIC 基本相同。 但是,在兩個(gè)培養基上測定的對鳥(niǎo)分支桿菌的MIC相差2～16倍之多。(2)大多數抗結核藥物對鳥(niǎo)分支桿菌等的活性很低。(3) 即使是有效藥物,大多數也顯示很弱的殺菌能力, 并顯示了株的差異性。這是因為它們有高MBC/MIC比值和MBC濃度往往超過(guò)血清峰值（Cmax)的緣故。 利福平對鳥(niǎo)分支桿菌野生株的MBC/MIC在4～64(pH6.8)和4～128(pH5.0), 顯示了株的差異。 600 mg口服利福平的最高血清濃度僅在8～12 μg/ml。

　　因此, 株依賴(lài)性和低敏感性成為包括鳥(niǎo)分支桿菌在內的分支桿菌藥物敏感性的特征。顯然，非結核分支桿菌的藥物敏感性測定不能套用結核分支桿菌的臨界濃度, 采取測定其敏感性程度的定量方法就成為唯一的正確選擇。

　　同時(shí), 由于大多數藥物顯示很弱的對非結核分支桿菌的殺菌活性, 采用藥物聯(lián)合用藥是必然的。研究發(fā)現, 在聯(lián)合用藥效應上,非結核分支桿菌同樣顯示株間的差異。 因此,對于非結核分支桿菌來(lái)說(shuō), 藥物間的并用效應是株的特征, 而非藥物的屬性, 因此, 需要個(gè)體化測定聯(lián)合用藥的效應。

　　二、藥物協(xié)同作用的定量測定

　　采用聯(lián)合用藥一般是為了(1)減少出現耐藥性的可能性。(2) 增加邊緣效應藥物的抗菌活性, 特別是免疫無(wú)反應患者所需的殺菌活性。(3)降低用藥劑量, 減少毒性。(4)擴大治療范圍。(5)治療同時(shí)出現的多種感染。

　　聯(lián)合用藥是結核病化療最重要的原則, 其主要目的是為了(1)降低耐藥性出現頻率。(2)用于起始耐藥率高的地區。(3) 設計合理的短程化療。在結核病短程化療聯(lián)合用藥中,利用不同藥物對結核患者體內不同環(huán)境和不同代謝狀態(tài)異質(zhì)性的菌群的各自作用設計聯(lián)合用藥是一個(gè)重要考慮。而在鳥(niǎo)分支桿菌等非結核分支桿菌治療中采用聯(lián)合用藥的目的有所不同,主要是利用藥物殺菌活性的相加或協(xié)同, 以克服“自然”耐藥性。因此,進(jìn)行野生株的聯(lián)合用藥并用效應的個(gè)體化測定是必要的。

　　并用藥物測定的程序如下: 首先測定臨床分離株的單藥MIC， 對于高于“敏感” 切點(diǎn)的株,再進(jìn)行2藥或多藥的并用效果測定。 其采用的藥物濃度應該是1/2, 1/4,1/8 MIC的單藥藥物濃度。 BACTEC法測定結果判定的標準是評估并用瓶?jì)壬�長(cháng)指數(GI)和單藥瓶?jì)?span>GI的商。此商值和并用藥物數的倒數相比較(1/并用藥物數)，兩藥并用時(shí)商值＜0.5, 可視作兩藥有協(xié)同作用；等于1時(shí), 為相加；≥2時(shí)，為拮抗。

　　三、藥物后效應(PAE)

　　藥物的另一個(gè)抗菌活性是PAE。PAE是藥物短時(shí)間脈沖式作用后,除去藥物后發(fā)現細菌再生長(cháng)或持續抑制的時(shí)間(天)。一般是將活菌數10倍增加作為再生長(cháng)的指標，在結核分支桿菌中稱(chēng)為生長(cháng)延遲。PAE反映非致死性損傷, 是一介乎MIC和MBC之間的活性。機制不清, 可能(1) 藥物在細胞作用部位有限的滯留或(2)亞致死性損傷。在PAE期間, 增加了對其他藥物的脆弱性。但在測定PAE時(shí), 應注意菌活性 和PAE。因此,一般采用Cmax和Cmax保持的時(shí)間測定PAE。結核分支桿菌的生長(cháng)延遲, 成為短程化療的一個(gè)依據。但是PAE在非結核分支桿菌中作用的有關(guān)資料很少,仍待研究。

　　四、定量測定

　　由于從未接觸藥物的結核患者的分離株對藥物敏感性程度相近,并遠離Cmax。因此, 可采用一臨界藥物濃度測定野生株的敏感性或耐藥性。 臨床實(shí)驗室常規采用的絕對濃度法, 1%比例法均采用臨界藥物濃度法。但是, 鳥(niǎo)分支桿菌等非結核分支桿菌敏感性離散程度高, 有株依賴(lài)性。因此, 個(gè)體化定量測定其株的敏感性程度是唯一可能的選擇。 這些定量指標主要是單個(gè)藥物和并用藥物的MIC和MBC測定。MIC是在一定培養時(shí)間內可抑制 99%以上的菌生長(cháng)的最低藥物濃度。測定中, 需要注意藥物失活和降解, 以期得到可信的數值。因此, 應慎用培養基和限定培養時(shí)間。美國國家實(shí)驗室標準委員會(huì )(NCCLS)規定一般細菌的藥敏測定時(shí)間是24～48 h, 緩慢生長(cháng)分支桿菌是2周(7H10 瓊脂培養基)、8 d(7H12液體培養基), 快速生長(cháng)分支桿菌為4 d。而結核分支桿菌是 3 周(7H10)和8天(7H12)。

　　另一個(gè)定量指標是MBC,是在24 h培養期間殺死99.9%接種菌群的最低藥物濃度。抑制商(IQ)( 平均Cmax/ 患者分離株)和強度指數(ID)(＞MIC的平均血清濃度/ 患者分離株MIC)是考核藥物治療的可能結果的另外兩個(gè)定量指標。但是, 在方法上也存在不同作者對接種量、藥物濃度和結果解釋上的不同意見(jiàn)。因此, 在鳥(niǎo)分支桿菌復合群中, 何時(shí)何株需要進(jìn)行藥物敏感性測定仍有爭議。

　　1．MIC測定：藥物敏感性測定中必須關(guān)注的是在培養基制備和測定過(guò)程中藥物的失活。在不同培養基中, 因為成分和制備過(guò)程中藥物變化程度不同出現不同的MIC。如羅氏培養基測定的利福平的MIC是40 μg /ml, 而在 7H10瓊脂培養基為1 μg /ml, 在7H12液體培養基中為0.25 μg /ml。緩慢生長(cháng)分支桿菌可采用類(lèi)似結核分支桿菌藥物敏感性測定的固體法(瓊脂、羅氏、小川培養基和7H10瓊脂培養基)。由于在固體培養基中測定的MIC可能并非真正的藥物濃度，因此,測定的MIC很難和血清峰值濃度及其他藥代動(dòng)力學(xué)指標比較。但是,可用于治療期間患者菌群敏感性變化的監測。

　　理想的MIC測定采用液體培養基的方法, 因為它可較好滿(mǎn)足藥物敏感性測定對藥物失活和時(shí)間的要求。因為 (1) 可1周內完成藥敏測定(瓊脂固體培養基需要2周)。(2) 藥物吸附和降解最少。(3)加入的濃度可認作是實(shí)際作用濃度。(4)測定的MIC 可與Cmax和其他藥代動(dòng)力學(xué)參數比較。(5) 可測定MBC,得到MBC/MIC比值。液體培養基中測定MIC的方法有集落形成單位（CFU）計數法, 濁度法和BACTEC法。7H12 培養基中CFU計數法,是最精確的方法，是其它方法的對照標準。但費時(shí)費事, 不能推薦為臨床實(shí)驗室方法。結核分支桿菌由于呈簇狀生長(cháng),干擾了濁度測定的精確度。大多數非結核分支桿菌如鳥(niǎo)分支桿菌和胞內分支桿菌培養物在培養液中呈散開(kāi)的生長(cháng), 適用于濁度法。 但是, 為了能在1周內獲得結果, 采用了大菌量接種。BACTEC輻射測定的基礎是放射測定的抗結核藥物結果和CFU測定結果一致。方法簡(jiǎn)單,但費用高。BACTEC的MIC測定是以生長(cháng)指數(GI)低于100倍稀釋對照管的最低藥物濃度^［4］。

　　在BACTEC系統中,結核分支桿菌藥敏試驗中敏感/耐藥的臨界濃度是以未接觸過(guò)藥物的野生株最高MIC值確定的。臨界濃度法節省時(shí)間、費用，但不能檢出仍對化療反應良好的患者的中度敏感或中度耐藥株的中間株。因此, 多切點(diǎn)濃度(一般是3個(gè)濃度)則可將臨床分離株分成四類(lèi): 敏感( 其MIC 處于野生敏感株的范圍內),中度敏感( 其MIC高于在敏感野生株中發(fā)現的范圍, 但兩倍低于文獻中介紹的最低的Cmax), 耐藥( 其MIC處于 Cmax水平)和非常耐藥( 其 MIC 實(shí)質(zhì)性高于Cmax)^［4］。由于化療失敗病例耐藥性改變非常迅速,同時(shí)敏感株的敏感程度離散度小，因此,在結核分支桿菌中測定中間株可能并不十分重要。一個(gè)測驗中,鳥(niǎo)分支桿菌對異煙肼的MIC₅₀為2.32 μg/ml, 而MIC₉₀則＞10 μg /ml。因此, 由于離散度大和株依賴(lài)性的原因, 采用某臨界藥物濃度判定鳥(niǎo)分支桿菌的敏感/耐藥相當困難, 需要尋找別的敏感/耐藥的標準。Isenberg 1988年提出一個(gè)假設: 患者分離株耐受性等于或高于Cmax株, 對化療無(wú)反應，而患者分離株對低于Cmax濃度敏感、可能對化療有反應，則成為敏感/耐藥標準的基礎。顯然,在標準中需要同時(shí)考慮兩個(gè)因素: 未接觸過(guò)藥物的野生株的最高MIC和血清 Cmax或組織濃度。

　　Heifets依據對藥物的敏感程度也將鳥(niǎo)分支桿菌分為四類(lèi): 敏感(其 MIC處于結核分支桿菌切點(diǎn)濃度內), 中度敏感(其 MIC 明顯低于Cmax,但在野生結核分支桿菌之上),中度耐藥( MIC處于Cmax水平上)和高度耐藥 (其MIC超過(guò)Cmax)。有關(guān)快速生長(cháng)非結核分支桿菌如偶然分支桿菌、龜分支桿菌等的研究較少, Heifets等^［3］認為也應適用于鳥(niǎo)分支桿菌的劃分原則。

　　2．MBC：對需氧菌而言,MBC是指作用18～24 h培養期間能殺死 99.9%菌群所需的最低藥物濃度。這樣的殺菌率實(shí)際上是一主觀(guān)性指標。由于大多數藥物對鳥(niǎo)分支桿菌等的殺菌活性低,測定MBC并與Cmax比較, 對于估價(jià)感染治療結果尤其是免疫低下患者是重要的。MBC的測定只有在液體培養基以CFU計數進(jìn)行。因此,臨床實(shí)驗室常難以進(jìn)行。

　　3．抑制商和強度指數都有助于對化療結果的預測。

　　五、藥物敏感測定結果的解釋

　　一般評價(jià)藥物活性有下列途徑: 試管內抑菌和殺菌活性測定,巨噬細胞內試管實(shí)驗, 產(chǎn)生體內條件的試管內模型實(shí)驗, 鼠實(shí)驗性治療和臨床驗證。 關(guān)于分支桿菌藥物敏感性測定雖然已經(jīng)積累了大量的資料, 但是臨床驗證較少。應該特別注意的是大多數臨床驗證是回顧性分析, 缺乏雙盲試驗驗證。

　　美國胸科學(xué)會(huì )（ATS）在1997年提出了對一些非結核分支桿菌進(jìn)行藥物敏感性測定的藥物名單及評價(jià)，詳見(jiàn)表1。

表1　考慮可作非結核分支桿菌敏感性測定的藥物(美國胸科學(xué)會(huì ),1997)

　　注：^*大環(huán)內酯類(lèi)(甲紅霉素,阿齊霉素,羅紅霉素)　　藥物敏感性測定是為了預期和評價(jià)放療方案對非結核分支桿菌病治療的療效。 鑒于非結核分支桿菌藥物反應特點(diǎn), 應切實(shí)考慮Heifets等關(guān)于分支桿菌藥物敏感性測定的雙個(gè)體化, 同時(shí)考慮患者藥代動(dòng)力學(xué)和患者分離株的藥效學(xué)定量測定^［4］。實(shí)際上, 由于有關(guān)非結核分支桿菌的臨床治療往往是回顧性分析, 缺乏前瞻性嚴格的雙盲性臨床試驗研究, 特別是實(shí)驗室的敏感或耐藥測定結果和臨床療效的關(guān)系分析。因此, 我們期望任何非結核分支桿菌病的臨床研究都應該包括藥物敏感性測定和臨床療效關(guān)系的研究。

參考文獻

　　1，Heifets LB, Iseman MD ，Lindholm-Levy PJ. Ethambutol MICs and MBCs for Mycobacterium avium complex and Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother，1986，30: 927-932.

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　　3，Heifets LB. Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections. London: CRC Press，1991.131.

　　4，Lee CN，Hefiets LB. Determination of minimal inhibitory concentration of antituberculosis drugs by radiometric and conventional methods. Am Rev Respir Dis,1987,136:349

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