木霉菌的發(fā)酵條件研究

在醫學(xué)和農業(yè)生產(chǎn)中木霉菌可以作抑制病害的生防菌，木霉菌的生長(cháng)及發(fā)酵條件是工業(yè)化批量生產(chǎn)木霉菌的提在本文中，主要研究了不同碳源、氮源、碳氮比、鈉鎂鹽、培養時(shí)間、溫度及pH對發(fā)酵產(chǎn)量的影響。
　　1 材料與方法
    
　　1.1 木霉菌株的來(lái)源 經(jīng)對峙培養及活體試驗后有效的BTC21（Trichoderma.harzianum）菌株。    
　　1.2 不同碳源對BTC21菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 基礎培養基為:蔗糖20g，硝酸銨5g，磷酸鈉2g，硫酸鎂1g，蒸餾水1000ml。分別有葡萄糖、果糖等。15碳源與其中的蔗糖置換，以無(wú)碳源的做對照，配制成不同碳源的培養液，每瓶50ml，接種培養3天的d=6mm的BTC21菌片3片，在25℃下振蕩培養（120rpm）。第8天測菌絲干重并觀(guān)察孢子產(chǎn)生情況，每處理重復3次。    
　　1.3 不同氮源對BTCZI菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 在基礎培養基中分別用等量的蛋白胨、氯化銨等八種氮源與其中的硝酸銨置換，配制成不同氮源的培養液，培養方法及測量方法同上。    
　　1.4 鈉、鎂鹽對BTC21菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 從15種碳源中選擇較好的碳源紅糖與蔗糖;從9種氮源中選擇理想的氮源酵母浸出汁與牛肉浸膏，比較兩種碳源與兩種氮源在不同組合下鈉、鎂鹽對BTC21菌絲干重及分生孢子產(chǎn)生情況的影響，培養及測量方法同上。    
　　1.5 不同碳氮比對BTC21菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 分別按紅糖:酵母為4:1、4:2、4:4、4:8、4:12的比例配制培養基，鈉鎂鹽含量不變，培養方法及測量方法同上。
　　1.6 液體發(fā)酵BTC21最適pH的選擇 綜合以上結果在最佳培養基的最佳碳、氮比下用HCL與NaOH調節發(fā)酵液的初始pH，設有pH2.0～12.0共14梯度，培養條件及測量方法同上。    
　　1.7 不同培養時(shí)間對BTC21菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 從培養第24h起每天定時(shí)測量孢子量的變化，測至第8天;從第72h起每天記錄菌絲干重的變化，測至第16天，培養條件及測量方法同上。    
　　1.8 液體發(fā)酵BTC21最適溫度的選擇 將BTC21接種在按比例配制好的培養基中，分別在15℃、20℃、22.5℃、25℃、27.5℃、30℃、35℃等溫度下進(jìn)行振蕩培養，測量5d后的菌絲干重及分生孢子量。
　　2 結果與討論    
　　不同培養條件對木霉菌菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢影響    
　　2.1 不同碳源培養BTC21后的性狀及對菌絲生長(cháng)與產(chǎn)孢的影響 液體培養基中以紅糖、肝糖為碳源，培養BTC21所獲得的菌絲干重最大，可能與紅糖中含有其它生長(cháng)所需成分有關(guān);其次為淀粉、蔗糖、L-（+）樹(shù)膠醛糖、麥芽糖、半乳糖;以山梨糖、木糖、密二糖、葡萄糖、甘露醇、果糖為碳源獲得的BTC21菌絲干重較輕;以菊糖、棉子糖為碳源菌絲干重最輕。    
　　不同碳源培養后性狀差異很大，缺碳對照、菊糖、棉子糖培養后產(chǎn)生紙屑或粉末狀菌絲，不形成菌球且量極少，麥芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、紅糖、半乳糖、密二糖、L-（+）樹(shù)膠醛糖、肝糖及蔗糖為碳源，液體培養過(guò)程中易產(chǎn)生小菌球（d≤0.3mm）;木糖、淀粉、乳糖為碳源時(shí)可產(chǎn)生不同大小的菌球。并且大數碳源不利于孢子的產(chǎn)生，其中以果糖、密二糖為碳源的培養濾液中觀(guān)察到了大量的木霉菌分生孢子;其次為蔗糖、半乳糖、菊糖、葡萄糖、L-（+）樹(shù)膠醛糖與淀粉。其余8種碳源的BTC21培養濾液中幾乎未見(jiàn)到分生孢子。綜合以上結果，液體發(fā)酵BTC21最利于菌絲生長(cháng)的碳源為紅糖，而最利于產(chǎn)生孢子的碳源是果糖與密二糖。    
　　2.2 不同氮源培養BTC21后的性狀及對菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 液體培養中以酵母浸出汁、牛肉浸膏為氮源的BTC21菌絲生長(cháng)最好，菌絲干重最大，產(chǎn)生d=2mm左右的小菌球;其次為蛋白胨，菌球直徑達到2.5mm;菌球直徑<1.5mm的谷氨酸、天門(mén)冬氨酸、硫酸氨、硝酸銨，氯化銨為氮源的菌絲干重較輕;以脲素、硝酸鉀為氮源的菌絲干重最輕，且菌絲未能形成菌球。    
　　最適合BTC21產(chǎn)生分生孢子的氮源是酵母浸出汁、蛋白胨與硫酸銨;其次為氯化銨與天門(mén)冬氨酸;牛肉浸膏、硝酸銨、谷氨酸、硝酸鉀、尿素則不利于產(chǎn)孢。    
　　綜合以上試驗結果，液體發(fā)酵BTC21最有利于菌絲生長(cháng)，同時(shí)又可促進(jìn)產(chǎn)孢的氮源為酵母浸出汁。    
　　2.3 鈉鎂鹽對BTC21菌絲生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 蔗糖、紅糖、牛肉浸膏與酵母浸出汁兩種碳源與兩種氮源的不同組合中，在加有Na 3 PO 4 與MgSO 4 時(shí)，培BTC21所獲得的菌絲干重較沒(méi)有鈉鎂鹽時(shí)大。以紅糖為碳源、酵母浸出汁為氮源，在有Na 3 PO 4 與MgSO 4 存在時(shí)BTC21菌絲干重最大。觀(guān)察培養后可以發(fā)現，對同碳氮組合，有無(wú)鈉鎂鹽對菌球的形態(tài)有很大的影響，在以蔗糖為碳源、酵母浸出汁與牛肉浸膏為氮源時(shí)，加入鈉鎂鹽情況下菌球直徑變小，在2mm左右，而菌球數量明顯增多，在紅糖為碳源、酵母浸出汁與牛肉浸膏分別為氮源時(shí)則與上述情況不同。    
　　2.4 不同碳氮比對BTC21生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 在液體培養中碳氮比為4/6時(shí)可以獲得最大的菌絲干重，4/8、4/10與4/12時(shí)菌絲干重有所下降，碳氮比分別為4/l、4/2與4/4時(shí)菌絲干重較小。但培養濾液中分生孢子濃度最大的碳氮比是4/2，其次依次為4/10，4/12與4/6，在碳氮比為4/1與4/8時(shí)，濾液分生孢子濃度最小。    
　　從發(fā)酵前后pH的變化上可以看出當pH前后變化較小時(shí)菌絲干重最大。    
　　2.5 不同pH對BTC21生長(cháng)及產(chǎn)孢的影響 液體發(fā)酵中BTC21在pH3.0～11.0之間都可觀(guān)察到分生孢子，其中以pH9.0時(shí)培養濾液中孢子濃度最大，較適宜產(chǎn)孢的pH為 8.0～10.0;pH3.0、pH4.0及pH11.0的培養濾液中孢子量不是很大。最適宜菌絲生長(cháng)的pH為5.5～6.5。    
　　2.6 不同時(shí)間對BTC21產(chǎn)孢的影響 從第6天開(kāi)始孢子開(kāi)始大量萌發(fā)生長(cháng)產(chǎn)生菌絲，第6～8天為發(fā)酵的適宜高峰期。第8天后無(wú)論是菌絲干重還是孢子濃度都呈下降趨勢。另外結合培養后的pH變化來(lái)看，第1～8天，濾液pH偏酸性，利于菌體生長(cháng)及產(chǎn)孢，第9～16天pH偏堿性，不利于菌體生長(cháng)及產(chǎn)孢，原因可能是在有限的營(yíng)養濃度內菌體達到最大增長(cháng)限度后自身開(kāi)始產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)抑制自身生長(cháng)并伴有菌體自溶的現象，一般培養12天后培養物變稀狀物、菌球消失。    
　　2.7 不同溫度對BTC21發(fā)酵的影響 菌絲干重最適宜溫度在22.5℃～25℃之間，產(chǎn)孢適宜溫度在25℃～27℃之間，30℃時(shí)孢子量便急劇變少。    
　　3 結論
　　研究中發(fā)現BTC21菌絲生長(cháng)和分生孢子形成對碳源和氮源都有不同的選擇性，可根據制備目的來(lái)選擇。如在制備以菌絲型為主的木霉菌生防制劑時(shí)最好選擇紅糖和肝糖，菌絲型制劑對培養產(chǎn)生抗生素類(lèi)物質(zhì)及胞壁降解酶有利。要制備分生孢子型木霉菌生防制劑時(shí)則需要選擇果糖與密二糖，孢子型制劑對營(yíng)養和空間競爭有利。因此在研究木霉菌發(fā)酵培養基時(shí)要考慮實(shí)際應用中對制劑的具體要求。本研究發(fā)現二糖或多糖比單糖有利于木霉菌主長(cháng)。今后需要考慮在不同發(fā)酵或生長(cháng)階段研究木霉菌碳、氮種類(lèi)的要求，便于今后生防木霉菌的補料發(fā)酵或連續發(fā)酵。本研究明確了木霉菌產(chǎn)孢和菌絲體形成的最佳條件，在最佳培養時(shí)間、pH、溫度等方面都明顯不同，因此可以根據生防制劑質(zhì)量標準和要求來(lái)進(jìn)行選擇，如偏酸條件有利于菌絲主長(cháng)，偏堿條件則有利于產(chǎn)孢;培養中前期有利于孢子形成，而中后期利于菌體生長(cháng)。相比較而言，適合產(chǎn)孢的培養時(shí)間范圍較窄，約第5～7天收集孢子最理想。與此類(lèi)似的還有，比較適合菌絲生長(cháng)的溫度范圍較寬，而有利產(chǎn)孢的適溫在22.5℃～27℃之間。在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化也會(huì )直接影響目的產(chǎn)物的積累，需要根據目的產(chǎn)物的不同來(lái)調節pH，若需要同時(shí)獲得多項產(chǎn)物時(shí)（如酶、孢子及菌絲等），可在培養過(guò)程中調節pH的變化以完成分段產(chǎn)物的積累�？傊�，在研究發(fā)酵條件時(shí)要盡量測定培養條件對菌種生物學(xué)指標的影響才能生產(chǎn)出各種不同要求的目的產(chǎn)物

 

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