摘 要：目的：探討耐氟突變后，其致釉質(zhì)片脫礦能力的改變。方法：采用原子吸收分光光度計，測定不同氟濃度條件下耐氟菌株培養物上清液中鈣離子濃度，并與親代菌株進(jìn)行比較。結果：耐氟菌株在無(wú)氟化物存在時(shí)，小于親代菌株；而當0.5mmol/L氟離子存在情況下，其大于親代菌株。差異具顯著(zhù)性。結論：耐氟菌株的產(chǎn)生將增加的致齲力。
(以下簡(jiǎn)稱(chēng)變鏈菌)為人類(lèi)齲齒主要致病菌，其高致齲力與自身具有很強的產(chǎn)酸力和脫礦力有關(guān)。局部高濃度氟化物的廣泛應用可導致變鏈菌耐氟菌株的產(chǎn)生。國外學(xué)者已在體內及體外獲得變鏈菌耐氟菌株，并對其致齲毒力進(jìn)行研究［1，2］。為探討國人變鏈菌耐氟菌株脫礦能力的改變，本實(shí)驗在體外通過(guò)測定變鏈菌耐氟菌株及親代菌株致釉質(zhì)，以推測其致齲能力的改變。
1 材料和方法
1.1 細菌和培養基
變鏈菌親代野生菌株為國際參考株S.mutans Ingbritt和本實(shí)驗室臨床分離株SSMU-M1；耐氟菌株為上述親代菌株體外經(jīng)逐步誘導法獲得［3］，分別命名為Ingbritt-FR和M1-FR。
培養基為含40g/L葡萄糖的乳酪消化大豆胨肉湯TSB。
1.2 菌懸液及培養基配制
按常規將4種待測菌株活化后，于TSB培養基中37℃微需氧培養18h。離心收集細菌。生理鹽水調吸光度ABS為1.0，備用。
在含40g/L葡萄糖TSB培養基中加入20g/L NaF液使終度分別為0、0.05和0.5mmol/L，用以細菌脫礦實(shí)驗。
1.3 釉質(zhì)片的制作
選擇臨床上因正畸需要而拔除的上頜前磨牙，體視顯微鏡下觀(guān)察無(wú)齲，無(wú)裂痕，無(wú)斑釉癥及四環(huán)素牙等疾患。徹底洗刷干凈，切去牙根，取冠部釉質(zhì)冷水沖洗下磨制成4mm×4mm×1mm大小釉質(zhì)片，超聲清洗5min，750ml/L乙醇消毒72h，備用。
1.4 細菌脫礦實(shí)驗
將消毒好的釉質(zhì)片用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次后，置于含有不同氟濃度的TSB培養基中，每個(gè)試管置4片，再按菌液：培養基為1：10(v/v)比例接種細菌，37℃微需氧培養72h(950ml/L N2，50ml/L CO2)。以不接種細菌但含有釉質(zhì)片的TSB培養基作陰性對照。
1.5 培養基中鈣、磷濃度測定
將含有釉質(zhì)片的72h細菌培養物，經(jīng)3?000r/min離心15min，取2ml上清液，用2g/L LaCl3溶液稀釋后，在原子吸收分光光度計(VIDEO22型，美國實(shí)驗儀器公司)上，以燈電流5mA，波長(cháng)422.7nm，狹縫寬度1.0nm以下，用火焰原子吸收法進(jìn)行檢測。
2 結果
各菌株在不同氟離子濃度下對釉質(zhì)片的脫礦情況(表1)。
表1 變鏈菌及耐氟菌株在不同氟濃度下的 (n=4) （略）
△表示耐氟菌株； 與親代菌株相比， *P<0.05，
**P<0.01，有顯著(zhù)性差異經(jīng)Student t檢驗：F=0mmol/L時(shí)，親代菌株Ingbritt和SSMU-M1致釉質(zhì)脫出的鈣、磷離子量多于耐氟菌株Ingbritt-FR 和M1-FR(P<0.05)；F=0.05mmol/L(相當于2mg/L)時(shí)，二者相近；F=0.5mmol/L時(shí)，耐氟菌株大于親代菌株(P<0.05)。臨床分離株與國際參考株表現相同(表1)。
3 討論
釉質(zhì)內含有大量無(wú)機物，按重量計算占95%，其中絕大部分為含有磷酸鈣的羥基磷灰石晶體。所以，釉質(zhì)中含有最多的無(wú)機組份是鈣，其次為磷，鈣與磷呈平行分布，且釉質(zhì)內Ca/P比值保持恒定，一般為1.60±0.08。齲齒是由于菌斑細菌酵解碳水化合物產(chǎn)生酸，酸積累達到一定數量和時(shí)間，牙齒中的礦物質(zhì)發(fā)生溶解，鈣和磷等無(wú)機離子由牙齒中脫出，發(fā)生脫礦而開(kāi)始。
本實(shí)驗發(fā)現，變鏈菌親代菌株和耐氟菌株產(chǎn)生的乳酸量皆可導致釉質(zhì)片脫礦。在無(wú)氟條件下，很大，最大鈣離子濃度為161.91mg/L(SSMU-M1)。氟的加入，可減少鈣和磷的溶出量，至0.5mmol/L氟離子濃度時(shí)，有大幅度下降，但仍有部分鈣磷溶出，且鈣與磷的溶出量基本呈平行關(guān)系。本實(shí)驗室所做的產(chǎn)酸實(shí)驗發(fā)現，變鏈菌親代株及耐氟株皆可使培養基終末pH值降至4.0左右，且在0.5mmol/L氟離子濃度下，仍可使pH值降至5.0以下。雖然細菌產(chǎn)酸使環(huán)境pH值降低的數值在有無(wú)釉質(zhì)存在下是不同的［3］，但該結果仍可說(shuō)明耐氟菌株產(chǎn)酸量與相吻合，即有無(wú)氟化物存在，耐氟菌皆可導致釉質(zhì)片的脫礦。表明耐氟菌株具有致齲潛力。這與van Loveren等學(xué)者的研究結果相吻合［4］。
從表1還可看出，無(wú)氟條件下，親代菌株Ingbritt和SSMU-M1的大于相應耐氟菌株Ingbritt-FR和M1-FR，這與pH7.0時(shí)兩種菌株產(chǎn)酸能力相符。實(shí)驗中還發(fā)現：在低濃度氟離子0.05mmol/L存在時(shí)，親代菌株與耐氟菌株鈣磷溶出量無(wú)顯著(zhù)性差異。當釉質(zhì)存在時(shí)，氟化物有兩方面作用：一是降低細菌產(chǎn)酸量，二是減慢釉質(zhì)溶解速度。這兩個(gè)作用對環(huán)境pH值可產(chǎn)生相反影響。產(chǎn)酸的抑制可升高終末pH值，而降低牙釉質(zhì)的溶解速度，因為減少了由于釉質(zhì)溶解而產(chǎn)生的緩沖作用，最終導致pH值的下降。研究發(fā)現，在0.5mmol/L 氟離子濃度時(shí)，氟化物抑制變鏈菌C180-2的產(chǎn)酸作用要占總作用的75%，而0.05mmol/L氟離子濃度時(shí)，氟對細菌產(chǎn)酸和釉質(zhì)脫礦的兩個(gè)作用達到平衡，終末pH值無(wú)變化［5］。本實(shí)驗結果顯示，0.05mmol/L氟離子濃度時(shí)，細菌脫礦受到抑制，但耐氟菌株與親代菌株鈣、磷離子釋出量無(wú)明顯差異；而0.5mmol/L氟離子濃度時(shí)，細菌產(chǎn)酸脫礦過(guò)程受到明顯抑制，上清液中鈣、磷離子濃度明顯下降。但耐氟菌株受抑制程度較輕，其明顯大于親代菌株。說(shuō)明氟化物的存在，特別是0.5mmol/L左右氟化物的存在，不能很好抑制耐氟菌株的生長(cháng)和代謝。
牙菌斑有吸收氟和蓄積氟的能力，正常情況下菌斑氟離子濃度為0.5mmol/L左右［5］。該結果提示，在正常菌斑氟離子濃度條件下，耐氟菌株的致齲潛力將大于親代變鏈菌株。說(shuō)明氟化物的應用存在一定局限性。在臨床防齲過(guò)程中，應尋找其它藥物與之聯(lián)合使用，以達到同樣甚至更好的防齲效果，而又可防止耐氟現象的發(fā)生
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