抗生素微生物檢定試驗設計表

①     加0.3%葡萄糖。

②     此緩沖液含3%氯化鈉。

③     系指普魯卡因青霉素注射液。

 補充：抗生素微生物檢定試驗設計表

[附注]

抑菌圈大小預測試驗方法：取雙碟6個(gè)，分為3組，每組2個(gè)，分別加入已融化的瓊脂培養基20ml，用陶瓦圓蓋覆蓋，待凝固后，作為底層培養基置37℃培養箱中保溫。另取已融化的瓊脂培養基分裝于3支大試管中，每支分裝20ml。將大試管置恒溫水浴中放冷至表1中規定各試驗菌的控制溫度，分別加入不同量的菌液，制成3種不同濃度的菌層培養基，搖勻，分別吸取3種濃度的菌層培養基各5ml，均勻地攤布在3組底層培養基上，每組雙碟用一種濃度的菌層培養基。然后按一劑量法、二劑量法或三劑量法用所欲測定抗生素的標準品溶液測定。測量各組雙碟抑菌圈的直徑，選擇抑菌圈直徑合適（一劑量法標準品溶液的中心濃度所產(chǎn)生的抑菌圈直徑應為15～18mm；二劑量法標準品溶液的高劑量所產(chǎn)生的抑菌圈直徑應為18～24mm；三劑量法標準品溶液的中劑量所產(chǎn)生的抑菌圈直徑應為15～18mm）的菌層濃度進(jìn)行效價(jià)測定。

表1       菌 層 培 養 基 的控 制 溫 度

（2）     影響效價(jià)測定的因素

1.試驗菌種：當試驗菌種中含有對抗生素敏感度不同的兩種或兩種以上的菌株時(shí)，由于各菌株的最低抑菌濃度不同，在形成抑菌圈時(shí)可能出現雙圈及邊緣模糊不清，影響測量抑菌圈的準確度。因此，應定期將試驗菌種進(jìn)行平板分離，經(jīng)涂片鏡檢后，挑選典型的單個(gè)菌落作為工作用菌種。陳舊的試驗菌培養物也會(huì )使抑菌圈邊緣模糊，故試驗時(shí)應用新鮮制備的試驗菌液。

2.培養基：培養基的質(zhì)量對抑菌圈的大小和清晰度都有影響，故對配制培養基用的幾種主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等都應通過(guò)預試驗選擇適宜的品種使用。瓊脂的使用量須隨季節不同加以調整，使培養基的硬度合適，太軟小鋼管容易下陷，太硬容易造成抗生素溶液從小鋼管底部漏出，可使抑菌圈破裂。

3.雙碟的制備：鋪雙碟底層培養基時(shí)，培養基的溫度不宜過(guò)高，一般將融化后的培養基在室溫冷至約70℃時(shí)加入雙碟中為宜，否則加雙碟蓋后，底層培養基上會(huì )出現冷凝水。當鋪菌層培養基時(shí)，由于冷凝水的局部冷卻和稀釋作用，可使菌層培養基凝固后表面不平。菌層培養基一定要鋪均勻，這是決定抗生素效價(jià)測定的關(guān)鍵。故要求鋪菌層時(shí)一定要與鋪底層時(shí)雙碟的位置、方向相一致。制備菌層時(shí)，培養基的溫度不要過(guò)高，受熱時(shí)間也不宜過(guò)長(cháng)，特別是一些對熱敏感的試驗菌更要注意。否則，可使試驗菌部分或全部被殺死，導致抑菌圈破裂或甚至無(wú)抑菌圈形成。因此，一定要按規定控制菌層培養基的溫度。

在雙碟培養基上放置小鋼管的距離要合適。當距離太小而抑菌圈又太大時(shí)，則相鄰兩個(gè)抑菌圈之間的抗生素擴散區中抗生素的濃度增大，形成互相影響的卵圓形或橢圓形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小鋼管時(shí)，若毛細滴管口不圓整或有小缺口，或管內有氣泡，均可使抗生素溶液從管口濺出；若加液太滿(mǎn)，溶液會(huì )從小鋼管口溢出；小鋼管底部不平，溶液會(huì )從底部漏出。以上原因均會(huì )造成抑菌圈不圓整或破裂成桃形。防止的辦法是滴管口要圓整，管口不能太細，管內不能有氣泡，加液時(shí)滴管口離校鋼管的距離不能太高，小鋼管兩端面要平。

4.雙碟的培養溫度和時(shí)間：培養箱的溫度要均勻，每組雙碟要放在同一層盤(pán)內，在培養過(guò)程中，不要開(kāi)啟培養箱，以免影響培養箱內的溫度。雙碟的培養時(shí)間也與抑菌圈的清晰度有關(guān)，如用藤黃八疊球菌作試驗菌種測定土霉素、四環(huán)素等效價(jià)時(shí)，在37℃培養16小時(shí)后，又是抑菌圈邊緣不清晰，可繼續培養一段時(shí)間，抑菌圈邊緣的菌群繼續生長(cháng)并產(chǎn)生色素，則可使抑菌圈逐漸變清晰。

5.抗生素污染：無(wú)抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在進(jìn)行抗生素效價(jià)測定時(shí)，要嚴防抗生素污染。防止的辦法是將配置和稀釋抗生素溶液所用的容器與制備培養基所用的容器嚴格分開(kāi)，切不可將抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附著(zhù)在微小塵埃上隨風(fēng)飄落在雙碟瓊脂培養基上，而造成抑菌圈破裂或無(wú)抑菌圈形成。

6.標準品：抗生素微生物檢定發(fā)的實(shí)驗設計師采用標準品與供試品對比試驗的平行線(xiàn)原理。因此，要求標準品與供試品必須是同質(zhì)的抗生素。如標準品與供試品所含的活性物質(zhì)不同，則標準品和供試品德兩條劑量反應線(xiàn)不成平行直線(xiàn)關(guān)系，就不能按平行線(xiàn)原理供試計算效價(jià)。各種抗生素都有它同質(zhì)的標準品，決不能用這一型抗生素組分制備的標準品，去測定另一型抗生素的供試品

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