抗生素微生物檢定法

抗生素微生物檢定包括兩種方法，即管碟法和濁度法。

測定結果經(jīng)計算所得的效價(jià)，如低于估計效價(jià)的90%或高于估計效價(jià)的110%時(shí)，應調整其估計效價(jià)，重新試驗（標準曲線(xiàn)法除外）。

除另有規定外，本法的可信限率不得大于5%。

  管碟法

本法系利用抗生素在瓊脂培養基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價(jià)的一種方法。

（一）  基本設備、用具、試驗材料及標準品

1.       基本設備

（1）      抗生素效價(jià)測定實(shí)驗室：室內應為半無(wú)菌，裝有紫外線(xiàn)燈，有固定的效價(jià)測定臺，臺面要求水平、防震。該室應與稀釋抗生素溶液的工作室隔離，以防止空氣、地面污染抗生素。

（2）      超凈工作臺：超凈工作臺應放置在潔凈工作室或半無(wú)菌室內。

（3）      抑菌圈面積測量分析儀：該儀器裝有微處理機，可自動(dòng)測量抑菌圈面積，并打印出統計分析的各種數據。

2.       用具

（1）       玻璃雙碟：為硬質(zhì)玻璃制品，碟底內徑約90mm，碟高16~17mm，碟底面應平，厚薄均勻無(wú)凹凸現象。新購的雙碟應按上述要求進(jìn)行檢查。檢查時(shí)可將雙碟底平放在水平臺上，每碟內加入2ml染料液，仔細觀(guān)察碟底反映的顏色深淺是否一致，挑選底部平的雙碟，洗凈晾干，置高溫烘箱內140~160 ℃干熱滅菌2小時(shí)后備用。

（2）       陶瓦圓蓋：應平，無(wú)凹凸現象。

（3）       不銹鋼小管：外徑7.8±0.1mm，內徑6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差異不超過(guò)±25mg，鋼管內外壁要求光潔，管壁厚薄要一致，兩端面要平坦光潔。

（4）       小鋼管放置器：四孔和六孔各一臺。

（5）       游標卡尺：精密度0.02mm。

（6）       滴管：管口應細長(cháng)平滑，不得有缺口。

3.       試驗材料

（1）      培養基及其制備方法

以下培養基、緩沖液制備時(shí)，均以115℃滅菌30分鐘。

培養基    Ⅰ

胨 5g  磷酸氫二鉀 3g 水 1000ml 牛肉浸出粉 3g 瓊脂 15~20g

除瓊脂外，混合上述成分，調節PH使比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)（用紙漿減壓濾過(guò)或紗布棉花濾過(guò)），調節PH值使滅菌后為7.8~8.0或6.5~6.6，分裝，滅菌。

培養基    Ⅱ

胨 6g 酵母浸出粉 6g 瓊脂 15~20g 牛肉浸出粉 1.5g 葡萄糖 1g  水 1000ml

除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節PH使比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調節PH值使滅菌后為7.8~8.0或6.5~6.6，分裝，滅菌。

培養基    Ⅲ

胨 5g 氯化鈉 3.5g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸氫二鉀 3.68g 水 1000ml

酵母浸出粉 3g 磷酸二氫鉀 1.32g

除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調節PH值使滅菌后為7.0~7.2，分裝，滅菌。

培養基    Ⅳ

胨 3g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml 葡萄糖 1g 瓊脂 15~20g

除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節PH使其比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調節PH值使滅菌后為6.5~6.6，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。

培養基    Ⅴ

胨 6g 酵母浸出粉 2g 瓊脂 15~20g 牛肉浸出粉 2g 葡萄糖 3g 水 1000ml

除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節PH使其比最終的PH值略高0.2~0.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調節PH值使滅菌后為7.8~8.0，分裝，滅菌。

培養基    Ⅵ

蛋白胨 7.5g 牛肉浸出粉 1.0g 葡萄糖 10.0g 酵母膏 2.0g 氯化鈉 5.0g 水 1000ml

除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調節ＰＨ值使滅菌后為6.5，分裝，滅菌。

營(yíng)養瓊脂培養基

胨 10g 瓊脂 15~20g  氯化鈉 5g 肉浸液 1000ml(牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替)

除瓊脂外，混合上述成分，調節PH使比最終的PH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，調節PH值使滅菌后為7.2～7.4，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。

改良馬丁瓊脂培養基

胨 5.0g 葡萄糖 20.0g 水 1000ml 硫酸鎂 0.5g 酵母浸出粉 2.0g 磷酸氫二鉀 1.0g 瓊脂 15～20g   

除葡萄糖和瓊脂外，混合上述成分，微溫溶解，調節PH值約為6.8，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過(guò)，加入葡萄糖溶解后，搖勻，調節PH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。

培養基可以采用相同成分的干燥培養基代替，臨用時(shí)，照使用說(shuō)明配制和滅菌，備用。

注意事項：①制備培養基的原材料，特別是胨、牛肉浸膏和瓊脂等對抑菌圈的大小與邊緣的清晰度有影響，故應預先進(jìn)行試驗，挑選使用。②不得在操作抗生素的實(shí)驗室內配制培養基。配制培養基所用的器皿應與接觸抗生素的器皿嚴格分開(kāi)，以免污染抗生素。③培養基中的瓊脂用量要隨氣候冷暖不同而增減。一般夏季用瓊脂的量比冬季多，其用量多少以培養基的硬度適宜為度。④培養基在加熱煮沸后所蒸發(fā)的水分必須用蒸餾水補足。⑤培養基滅菌后，應放于37℃培養箱中培養24～48小時(shí),證明無(wú)菌后方可使用。使用期限約為1個(gè)月，不宜保存過(guò)久，以免營(yíng)養價(jià)值降低。⑥制成的培養基倒入雙碟內凝固后應透明，不得有沉淀。

（2）     緩沖液

磷酸鹽緩沖液（PH6.0）：取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml,濾過(guò)，

分裝，滅菌。

磷酸鹽緩沖液（PH7.0）：曲磷酸氫二鈉9.39g與磷酸二氫鉀3.5g,加水使成1000ml，

濾過(guò)，分裝，滅菌。

磷酸鹽緩沖液（PH7.8）：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，

濾過(guò)，分裝，滅菌。

[附注]配制緩沖液所用化學(xué)試劑的規格應為分析純試劑。

（3）試驗用菌種：試驗用菌種對被測定的抗生素應具有高度的敏感性，在一般培養基上能生長(cháng)繁殖，易于保存，不應變異或變異性小，無(wú)致病性，具有敏銳的生化培養特性，能適合多種抗生素的檢定，最好是芽胞菌，因芽胞菌制備成懸液易于保存，不易變異，使用時(shí)間長(cháng)。

①試驗用菌種的保存：衛生部藥品生物制品檢定所提供的菌種為冷凍干燥菌種，可保存在5℃的冰箱內。以無(wú)菌操作啟開(kāi)凍干菌種，接種在普通瓊脂斜面上，置37℃培養箱中培養20～22小時(shí)。取出放至室溫后，放入5℃冰箱中保存，即為試驗用菌種。試驗用菌種每月傳代一次，每季度平板分離一次。

②菌種的接種方法：從冰箱中取出菌種1支，放至室溫。另取新鮮制備的普通瓊脂斜面1支（如瓊脂斜面已干燥無(wú)凝結水者，則不可使用），注明菌名、接種日期，與菌種斜面一同放于預先用1‰新潔爾滅溶液擦拭過(guò)，并用紫外線(xiàn)燈照射30分鐘后的工作臺上（或超凈工作臺內）。操作人員用新潔爾滅溶液洗手，然后按無(wú)菌操作要求開(kāi)始接種。先將菌種斜面和待接種的培養基斜面試管口上的棉花塞通過(guò)酒精燈火焰稍稍扭動(dòng)一下，以免接種時(shí)不易拔出棉塞。用左手握住菌種斜面和待接種的培養基斜面，將試管口靠近火焰旁，右手拿接種棒后端，在火焰上將接種環(huán)燒紅約30秒鐘，然后將全部金屬棒通過(guò)火焰往返3次，用右手無(wú)名指及小指同時(shí)將菌種斜面和待接種的培養基斜面試管口的棉塞拔出，并將兩支試管口在火焰上通過(guò)一下，立即將接種環(huán)伸入菌種斜面管內，先在近管壁的瓊脂培養基表面上靠一下，使稍冷卻，再移至菌苔上刮取少量菌苔，迅速將接種棒取出，并立即伸入到待接種的培養基斜面管內，由下至上在培養基斜面上輕輕曲折移動(dòng)1次，取出接種棒，立即在火焰旁將原來(lái)的棉塞塞上，然后將接種棒上的殘余細菌在火焰上燒灼，燒灼時(shí)應先將接種環(huán)離沾菌處的遠端燒灼，使其傳熱至沾菌處，待菌苔已枯焦、炭化后，才能直接燒灼，切不可直接猛火燒灼沾菌處，以防細菌濺出。接種完畢后，將細菌管置37℃培養箱內培養22～24小時(shí)（霉菌管一般置26～27℃培養箱內培養7天）。取出放冷至室溫后，放入5℃冰箱中保存。

③試驗用菌液的制備和保存

枯草芽孢桿菌懸液    取枯草芽胞桿菌[CMCC(B)63501或CVCC717]的營(yíng)養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營(yíng)養瓊脂培養基的培養瓶中，在35～37℃培養7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。

（取枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]試驗用菌種斜面1支，按無(wú)菌操作要求加入滅菌水2ml，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種于盛有30ml普通瓊脂培養基的100ml三角瓶中，旋轉三角瓶使全部瓊脂培養基表面被菌液浸潤，多余的菌液用吸管吸出棄入5%石炭酸消毒液中。將已接種的三角瓶置35～37℃的培養箱中培養7～10天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，制成懸液，在65℃水浴中加熱30分鐘，即得。置5℃冰箱中保存，可使用6個(gè)月。）

短小芽孢桿菌懸液    取短小芽孢桿菌[CMCC(B)63202或CVCC709]的營(yíng)養瓊脂斜面培養物，照上述方法制備。

金黃色葡萄球菌懸液    取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003或CVCC1882]的營(yíng)養瓊脂斜面培養物，接種于營(yíng)養瓊脂斜面上，在35～37℃培養20～22小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

（取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]試驗用菌種斜面1支，用接種棒取培養物接種至10ml培養基Ⅲ中，接種時(shí)在靠近培養基液面的試管壁上摩擦，使菌苔均勻混懸于液體培養基中，在35～37℃培養箱中培養16～18小時(shí)，取出，應成均勻的懸液，無(wú)菌膜及凝集沉淀，此菌液僅供當日使用。）

藤黃微球菌（藤黃八疊球菌）懸液    取藤黃微球菌[CMCC(B)28001或CVCC1600]德?tīng)I養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營(yíng)養瓊脂培養基的培養瓶中，在26～27℃培養24小時(shí)，或采用適當方法制備的菌斜面，用培養基Ⅲ或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

（取藤黃八疊球菌[CMCC(B)28001]試驗菌種斜面1支，加入2ml培養基Ⅲ，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種于盛有30ml普通瓊脂培養基的100ml三角瓶中，旋轉三角瓶使全部瓊脂培養基表面被菌液浸潤，多余的菌液用吸管吸出棄入5%石炭酸消毒液中，將已接種的三角瓶置26～27℃培養箱中培養24小時(shí)，用5ml培養基Ⅲ將菌苔洗下制成均勻的懸液。此懸液在5℃冰箱中保存可使用1個(gè)月。）

大腸桿菌懸液    取大腸桿菌[CMCC(B)44103或CVCC2801]的營(yíng)養瓊脂斜面培養物，接種于營(yíng)養瓊脂斜面上，在35～37℃培養20～22小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。

（1）     雙碟的制備：取直徑約90mm、高16～17mm的平底雙碟，用滅菌大口吸管

分別注入加熱融化的培養基20ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層。另取培養基適量加熱融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入規定的試驗菌懸液適量（能得到清晰的抑菌圈為度。二劑量法標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法標準品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm），充分搖勻，用滅菌大口吸管在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置水平臺上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內徑6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm）4個(gè)（二劑量法）或6個(gè)（三劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。

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