抗生素微生物檢定管碟法在中國藥典中的應用及操作要點(diǎn)
錄入時(shí)間:2010-11-18 10:29:10
來(lái)源：青島海博
抗生素微生物檢定法可分為：（1）稀釋法；（2）比濁法；（3）瓊脂擴散法（管碟法和打孔法）。各國藥典通常采用后兩種方法測定抗生素的效價(jià)。
管碟法：利用抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養基內成球面形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區，抑制了試驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈。
此法系根據抗生素在一定濃度范圍內，對數劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線(xiàn)關(guān)系而設計，通過(guò)檢測抗生素對微生物的抑制作用，比較標準品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價(jià)。
原理：利用抗生素在固體培養基中的平面擴散作用，依據量反應平行線(xiàn)原理并采用交叉實(shí)驗設計方法，在相同實(shí)驗條件下通過(guò)比較標準品（已知效價(jià)）和供試品兩者對所接種試驗菌產(chǎn)生的抑菌圈（直徑或面積）大小，來(lái)測定供試品效價(jià)的一種方法。
管碟法的操作步驟：
1、預試驗：確定最佳的試驗條件：調整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養基等，使抑菌圈的大小符合規定：一劑量法中心點(diǎn)的抑菌圈直徑應在16～17.5mm，二劑量法高劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法中間劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在15～18mm。
2、試驗準備：雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養基、緩沖液的準備、半無(wú)菌間的紫外消毒等。
3、雙碟的制備：每只雙碟加底層培養基約20ml，待培養基凝固后，將雙碟放入35～37℃培養箱中，待用。
4、供試品、標準品溶液的制備：估計供試品的效價(jià)，根據試驗要求設計供試品、標準品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標準品相關(guān)劑量的溶液。
5、菌層的制備：注意菌層培養基溫度；根據預試驗確定加入菌層培養基的菌液量，注意制備菌層的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。
7、雙碟的培養：根據培養溫度的要求在培養箱中進(jìn)行培養，培養箱中水平碟放的雙碟數以不超過(guò)三層為宜。
8、抑菌圈的測量：抑菌圈測量?jì)x的使用，每組試驗雙碟應在相同的測量參數下進(jìn)行測量。手工測量：游標卡尺
9、結果的可靠性檢驗及效價(jià)測定：抑菌圈測量?jì)x提供計算結果或手工計算結果。
操作要點(diǎn)
第一步一般應制成500或1000單位/毫升的溶液，以后逐步稀釋至供試濃度的溶液，稀釋步驟應為3～4步。
溶解：對于需用乙醇溶解的樣品，由于溶解樣品時(shí)所用乙醇量較大，加滅菌水后溶液放熱，因此需充分搖勻后加滅菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室溫后再稀釋至刻度。
標準品溶液與供試品溶液濃度的比值D應控制在±5%以?xún)�，以保證兩者濃度的偏差在一定范圍內。
試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時(shí)應保持菌種及菌液的新鮮。
一般菌種一月轉種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進(jìn)行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。
試驗菌傳代最好不超過(guò)5次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養物用滅菌水洗下后，應在65℃加熱30分鐘，使菌體的菌齡一致，用革蘭氏染色，應有芽孢85%以上。
加入菌懸液的體積，一般不少于0.3ml，并且不大于上層培養基體積的2%。如果加入菌懸液的體積過(guò)小，則在同次實(shí)驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大，造成實(shí)驗誤差；如果加入菌懸液的體積過(guò)大，則會(huì )使上層培養基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養基中可能造成培養基結塊，影響測定結果。對于加入菌懸液體積的控制，可通過(guò)調節菌懸液的濃度來(lái)實(shí)現。
在制備菌層培養基時(shí)，將菌液加入菌層培養基后，立即充分搖勻，但應避免產(chǎn)生氣泡。
加入芽孢懸液時(shí)，菌層培養基的溫度為65℃，對非芽孢懸液時(shí)，菌層培養基的溫度一般為48～50℃。
放置孵箱培養時(shí)排放應不得超過(guò)三層，避免因培養溫度不均勻而導致各雙碟中抑菌圈大小不一。
抗生素原料藥：不含輔料的藥物制劑原料，一般其效價(jià)以純度（u/mg或?g/mg）表示。檢驗時(shí)，可參考該品種的藥品標準純度限度規定或廠(chǎng)方提供的純度估計效價(jià)，取樣試驗，如估計效價(jià)與實(shí)際效價(jià)相差較遠時(shí)，即測定所得效價(jià)超出估計效價(jià)的±10%時(shí)，則重新估計效價(jià)，再做準確測定。
粉針劑：指注射用無(wú)菌粉末或凍干品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓶?jì)�，一般測定其純度（u/mg或?g/mg）或整瓶效價(jià)。
取裝量差異項下的內容物，稱(chēng)取適量（50mg以上，根據標示量及平均裝量折算估計效價(jià)，并按估計效價(jià)及量瓶體積計算取樣量），置量瓶中，加標準中規定的溶劑溶解，稀釋?zhuān)瑴y定，計算出1mg的效價(jià)單位數，再根據平均裝量及標示量計算平均每瓶的百分含量。
水針劑（注射液）：即抗生素的滅菌水溶液，標示量一般按每毫升含效價(jià)單位計。
效價(jià)測定時(shí)，量取平均裝量項下的內容物或5～10支的內容物，混勻，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭凈，再棄去多余的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部?jì)缺诰従徚魅胍咽⒂幸欢咳軇ㄒ悦饪股亟Y晶析出）的量瓶?jì)�，混勻，繼續加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規定的濃度。
素片、薄膜衣片：稱(chēng)取20片的總量，求出平均片重，研細混勻后，精密稱(chēng)取適量（約相當于1片的重量或根據標示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標準中規定的溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再量取適量稀釋至規定濃度。
注意點(diǎn)：研磨時(shí)應注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內含輔料較多，輔料可能漂浮于溶液表面，稀釋時(shí)量取供試溶液應讀取輔料下層的溶液切面；如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應加以注意。為節約供試品，可與重量差異檢查結合進(jìn)行。
糖衣片、腸溶片：取標準中規定的片數，置于乳缽中，研細，分次加入規定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶體積根據供試品標示量、所取片數及抗生素儲備液濃度（一般為1000單位/ml）選定，用規定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內，精密吸取量瓶中的上層液適量，作進(jìn)一步稀釋。個(gè)別品種標準如同時(shí)收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規定薄膜衣片也取整片制備供試溶液。
膠囊劑：取裝量差異項下的內容物，混合均勻，研細，根據平均裝量，精密稱(chēng)取約相當于1粒膠囊的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項下的方法進(jìn)行。
顆粒劑、干混懸劑：取裝量差異項下的內容物，混勻，根據平均裝量，精密稱(chēng)取約相當于1袋（包）的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋制成供試品溶液。測得效價(jià)后，再根據裝量差異項下的平均裝量，計算出平均每袋（包）的效價(jià)，根據標示量即可算出含量。
軟膏劑、眼膏劑：擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開(kāi)封口，置于干燥器內約1小時(shí)，取干燥的潔凈分液漏斗，帶手套操作，將膏劑軟管連同內容物在天平上稱(chēng)重，取出，將內容物擠入分液漏斗，量約2g，再稱(chēng)取膏劑軟管的重量，按減重法以前后稱(chēng)量之差計算分液漏斗內膏劑供試品的量，以不含過(guò)氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質(zhì)，但基質(zhì)中的抗生素則應不溶于或幾乎不溶于該有機溶劑中，以避免提取過(guò)程中抗生素的損失。按標準中的規定加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質(zhì)溶解，用規定的緩沖溶液提取抗生素至水相中，用緩沖溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加緩沖溶液至刻度，依法操作，計算效價(jià)。
實(shí)驗要點(diǎn)
磷霉素鈉，磷霉素鈣，磷霉素氨丁三醇
主要問(wèn)題：抑菌圈偏小
解決：
1. pH9.0抗Ⅱ號培養基（pH7.8～8.0）
2. 滴加藥液后，室溫放置1小時(shí)后，放入孵箱內培養。
3. 培養時(shí)間以24小時(shí)為宜，培養時(shí)間短，抑菌圈清晰度不好，培養24h后如抑菌圈仍不清晰，應室溫放置一段時(shí)間待清晰后再測量。
啤酒酵母菌的培養
主要問(wèn)題：生長(cháng)不良
CP2005：抗Ⅴ號瓊脂斜面及抗Ⅳ瓊脂斜面
解決：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培養基；2. 32～35℃培養24小時(shí)
沙氏培養基
蛋白胨10g 葡萄糖40g
瓊脂13g 水1000ml
調節滅菌后pH5.4～5.8
YPD培養基
蛋白胨10g 葡萄糖40g
酵母粉5g 瓊脂13g
水1000ml
管碟法特點(diǎn)：
優(yōu)點(diǎn)：基本操作和設計適用于各種抗生素，試驗結果較穩定；樣品用量少，靈敏度高；適合于大批樣品的測定。
缺點(diǎn):凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會(huì )干擾測定結果；試驗過(guò)程長(cháng)，需第二天才有結果；操作手工化，需熟練人員才能得到較正確的結果；受擴散因素的影響，如培養基原材料的質(zhì)量，一般瓊脂中的雜質(zhì)可能影響擴散速度及效價(jià)強度
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