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【關(guān)鍵詞】 效價(jià)；比濁法；乙酰螺旋霉素
Content determination of acetylspiramycin tablets
by turbidimetric method
Liu Ying and Cui Chunying
ABSTRACT Objective To establish a turbidimetric method for the content determination of acetylspiramycin tablets. Method The test organism was Staphylococcus aureus. Adjust the bacterial suspension of Staphylococcus aureus inoculation with about 0.5%ratio， at ℃ for 3.5～4.5 hours. Results The linear range was
KEY WORDS Potency; Turbidimetric method; Acetylspiramycin tablets
乙酰螺旋霉素是螺旋霉素乙�；苌�，屬半合成大環(huán)內酯抗生素，是單乙酰螺旋霉素II、單乙酰螺旋霉素III與雙乙酰螺旋霉素II、雙乙酰螺旋霉素III四個(gè)組分為主的混合物，毒性低，不良反應小，較廣泛有效地應用于金葡菌、鏈球菌、肺炎桿菌、大腸埃希菌、淋球菌等引起的感染［1］。
因乙酰螺旋霉素為多組分抗生素，一般的化學(xué)分析方法或高效液相色譜法均無(wú)法測定其含量，雖有文獻［2，3］報道可用紫外分光光度法測定乙酰螺旋霉素制劑的含量，但紫外分光光度法專(zhuān)屬性差，測定結果誤差較大。對乙酰螺旋霉素及其制劑的含量測定，中國藥典2005年版［4］采用管碟法測定其效價(jià)，但管碟法操作繁雜、耗費時(shí)間慢長(cháng)，影響因素多，且需有經(jīng)驗的實(shí)驗人員才能得到理想的結果，同時(shí)由于乙酰螺旋霉素是多組分，容易導致雙圈現象，使重現性差。比濁法是一種快速、方便、經(jīng)濟的測定抗生素含量的方法，中國藥典2005年版微生物檢定法新增濁度法測定慶大霉素效價(jià)［5］。國內正在研制微生物比濁法測定儀，我們應用該測定儀在線(xiàn)自動(dòng)測定乙酰螺旋霉素效價(jià)，減少了多種實(shí)驗影響因素，節省了大量人力勞動(dòng)，4h即可得到實(shí)驗結果。
1 儀器與試劑
1.1 儀器
TU1901紫外分光光度計，北京普析通用公司；CZB1抗生素光度測量?jì)x，北京潮聲公司；WBS100微生物比濁法測定儀與ZY300多功能微生物自動(dòng)測量分析儀均是北京先驅威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)；BP211D天平，Mettler公司。1.2 菌株、樣品、培養基與試劑
金葡菌CMCC26003、大腸埃希菌 CMCC44103與肺炎克雷伯菌CMCC46117均由中國藥品生物制品檢定所提供。
乙酰螺旋霉素標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。乙酰螺旋霉素片為河南天方藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；乙酰螺旋霉素片為石藥集團藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。
營(yíng)養瓊脂培養基與抗生素檢定培養基III均為北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)；0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液均按中國藥典2005年版二部附錄［5］配制。
2 效價(jià)測定
2.1 管碟法
按中國藥典2005年版二部方法［4］測定。
2.2 比濁法
含菌培養基的配制 取金葡菌新鮮斜面培養物，接種于營(yíng)養瓊脂培養基小斜面上，置35～37℃培養18～20h，用0.9%氯化鈉溶液洗下菌苔，并用0.9%氯化鈉溶液稀釋?zhuān)蛊湓?SPAN lang=EN-US>650nm波長(cháng)處的吸光度約為1.0。取菌液約5ml加至培養基100ml中，搖勻，為含菌培養基。
溶液的配制
標準品溶液 精密稱(chēng)取乙酰螺旋霉素標準品適量，加乙醇溶解后，加滅菌水稀釋至
供試品溶液 精密稱(chēng)取研細后的乙酰螺旋霉素片適量，加乙醇溶解后，加滅菌水稀釋至
培養與測定 分別精密吸取實(shí)驗用標準品溶液和供試品溶液各1.0ml，加入滅菌培養管中，再加入含菌培養基9.0ml，置抗生素比濁法測量?jì)x內，于℃培養。另取稀釋溶劑1.0ml，空白培養基9.0ml，混勻，作為空白對照；再取稀釋溶劑1.0ml，含菌培養基9.0ml，混勻，作為陽(yáng)性對照。儀器在線(xiàn)于530nm波長(cháng)處測定各管金葡菌對數生長(cháng)期內不同培養時(shí)間下的吸光度或濁度。根據量反應平行線(xiàn)原理［6］計算供試品的效價(jià)值。
3 結果
3.1 測定條件的選擇
實(shí)驗菌的選擇由于乙酰螺旋霉素適用于革蘭陽(yáng)性菌如金葡菌、鏈球菌、肺炎桿菌、大腸埃希菌等，根據其抗菌作用與中國藥典2005年版常用的效價(jià)測定用菌株，初步選擇大腸埃希菌、金葡菌與肺炎克雷伯菌為實(shí)驗用菌株，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。
繪制菌株在不同抗生素濃度的生長(cháng)曲線(xiàn)，根據生長(cháng)曲線(xiàn)及在不同抗生素濃度下菌液吸光度值的變化，發(fā)現大腸埃希菌對乙酰螺旋霉素不敏感，對不同濃度的乙酰螺旋霉素，培養后菌液吸光度值相差很小，菌株生長(cháng)曲線(xiàn)無(wú)明顯地對數生長(cháng)期，不適用。乙酰螺旋霉素對肺炎克雷伯菌抑制作用較強，對不同濃度的乙酰螺旋霉素，培養后菌液吸光度值差值較小，且菌生長(cháng)緩慢，也不適用。金葡菌對乙酰螺旋霉素敏感，對不同濃度的乙酰螺旋霉素，培養后菌液吸光度值差值較合適，菌株生長(cháng)曲線(xiàn)有較好地對數生長(cháng)期，可以選擇。
圖1 金葡菌的生長(cháng)曲線(xiàn)
實(shí)驗菌濃度的選擇 按含菌培養基的配制方法，加入不同體積的菌液2.0～8.0ml至培養基100ml中，結果顯示菌液濃度太低時(shí)，細菌生長(cháng)受抗生素抑制，生長(cháng)時(shí)間達4h，吸光度值仍達不到0.2；菌液濃度太高時(shí)，吸光度值很快超過(guò)0.7，且由于培養基中含菌量太多，菌本身互相抑制，導致菌生長(cháng)雜亂，偏離平行較差；最終選擇菌液濃度為0.5%左右，此時(shí)菌生長(cháng)良好，有明顯地對數生長(cháng)期，吸光度一般為0.3～0.7，偏離平行良好。
3.2 線(xiàn)性與范圍
精密吸取實(shí)驗用貯備溶液適量，分別用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至下列濃度：1.2～31
A=-0.9514ogC+1.4662 r=0.9995
3.3 測定方法
標準曲線(xiàn)法 標準品溶液的濃度分別為6.4、8.0、10.0、12.5和
二劑量法 標準品溶液與供試品溶液的高低濃度分別為8.0和
照中國藥典2005年版二部附錄與
3.4 準確度
精密稱(chēng)取乙酰螺旋霉素標準品適量，按乙酰螺旋霉素片處方加入輔料，照供試品溶液的稀釋方法稀釋至實(shí)驗濃度，作為供試品溶液。標準品溶液的配制同上，劑量為80%、100%、120%的平均回收率為100.7%，RSD=1.4%，在效價(jià)測定范圍內，回收率良好。
3.5 精密度
實(shí)驗用標準品溶液的配制同2.2，同時(shí)也用作供試品溶液，按標準曲線(xiàn)法重復測定6次，測定值分別為98.64%、101.33%、99.51%、102.29%、101.14%和102.50%，RSD=1.5%，在效價(jià)測定范圍內，該方法精密度良好。
3.6 測定樣品
用兩個(gè)廠(chǎng)家不同測定原理的儀器對3批乙酰螺旋霉素片進(jìn)行測定并與管碟法結果進(jìn)行比較，結果無(wú)顯著(zhù)性差異。
4 討論
比濁法較管碟法有明顯優(yōu)點(diǎn)，操作方便、快速，可信限率低，尤其是儀器在線(xiàn)自動(dòng)測量，使結果更準確，精密度更好，值得推廣應用，對醫院和企業(yè)檢測半成品能縮短檢測時(shí)間，提高工作效率。
文獻［6，7］報道，在比濁法實(shí)驗中，pH7.0是培養 表1 乙酰螺旋霉素片的比濁法與管碟法效價(jià)測定WBS100微生物比濁法測定儀采用的是新型半導體檢測器，CZB1抗生素光度測量?jì)x采用的是光電倍增管，兩者采集透過(guò)光的原理有差別，但測定的都是光的透過(guò)率，最后換算為吸光度，兩者測定原理不同，但由于效價(jià)測定是與標準品同時(shí)測定，所以都可達到測定抗生素供試品效價(jià)的目的。兩種儀器均為我國正在研制中的比濁法測定儀器，硬件與軟件均正處在完善的過(guò)程中，隨著(zhù)時(shí)間的推移，硬件與軟件都會(huì )更加成熟。
【參考文獻】
［1］ 四川抗菌素工業(yè)研究所. 抗生素及抗感染藥物［M］. 上海：上�？茖W(xué)技術(shù)出版社，1981：213.［2］ 齊薊，李振龍. 紫外分光光度法測定乙酰螺旋霉素含量［J］. 黑龍江醫藥科學(xué)，2001，24：50.［3］ 陳俊芳，王環(huán)平，張振軍. 紫外分光光度測定乙酰螺旋霉素片的含量［J］. 中國藥事，2002，16：699.［4］ 國家藥典委員會(huì ). 中華人民共和國藥典2005年版［S］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：7.［5］ 楊亞莉，胡昌勤. 中國藥典2005年版微生物檢定法的增修訂情況及要點(diǎn)［J］. 中國抗生素雜志，2005，30：721～726.［6］ 國家藥典委員會(huì ). 中華人民共和國藥典2005年版［S］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄79～84.［7］ Donald P， Paul A， Walter H， et al. Semiautomated turbidimetric microbiological assay for determination of cefazolin ［J］. Antimicrob Agents Chemother，1974，5:223～227［8］ Joseph P， Ronald P. Turbidimetric bioassay for carbenicillin ［J］. Antimicrob Agents Chemother，1973，3:364～368.
