一種評價(jià)光合細菌調水作用的實(shí)驗方法探討

光合細菌（photosynthetic bacteria,簡(jiǎn)稱(chēng)PSB）是一群能在厭氧光照或好氧黑暗條件下，利用有機物作供氧體和碳源進(jìn)行不放氧光合作用細菌的總稱(chēng)。光合細菌能有效利用水體中過(guò)剩的有機物作為自身繁殖的營(yíng)養源，間接增加溶氧，穩定水質(zhì)，可作為水產(chǎn)養殖水質(zhì)凈化劑，因而一直得到廣泛關(guān)注。因為光合細菌種類(lèi)多，不同養殖水體條件差異較大，加上野外條件下的影響因素十分復雜，有關(guān)光合細菌產(chǎn)品在實(shí)際養殖水體中的應用效果評價(jià)一直存在很大難度。
光合細菌對養殖水體的調節作用主要是影響水體的浮游生物，特別是藻類(lèi)的生長(cháng)作用，因而會(huì )影響到水體的初級生產(chǎn)力。黑白瓶測氧法是水域生態(tài)學(xué)中評價(jià)水體生產(chǎn)力的一種常用技術(shù)方法。本文通過(guò)分析利用傳統的黑白瓶測氧法評價(jià)光合細菌調水作用實(shí)驗方法的可行性，以期獲得實(shí)驗室條件下評價(jià)光合細菌調水作用的簡(jiǎn)易方法。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗材料
1.1.1 材料與試劑
2.5 L玻璃采水器1個(gè)，250 ml白瓶25個(gè)，掛瓶架4臺；溶解氧滴定所用設備及藥品參照GB 7489—87。
1.1.2 光合細菌菌種
由廣東海大集團股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心微生物實(shí)驗室篩選提供,經(jīng)鑒定為沼澤紅假單胞菌。
1.1.3 水樣
采自廣州市番禺區城郊一人工養殖池塘，水體透明度為20 cm左右。
1.2 實(shí)驗方法
于2008年3～8月間,分別進(jìn)行黑白瓶測氧法試驗。
1.2.1 水樣采集
在所選池塘采集約50 cm深度的水樣后，小心將水樣注入水樣瓶。作初始氧量測定用的水樣瓶應立即固定，待加入光合細菌的瓶應置于陰涼處，避免日光直射。
1.2.2 光合細菌的加入
將試驗用光合細菌制劑以生理鹽水適當稀釋后，再按最終濃度要求（10、100 mg/l）吸取稀釋液到水樣瓶中，灌瓶后輕輕攪勻，每個(gè)樣品設置3次重復。
1.2.3 水樣光照培養
灌瓶后的黑白瓶在室溫下進(jìn)行自然光照培養處理，瓶與瓶的間距以互不遮光為原則，光照培養過(guò)程中，每隔30 min輕搖瓶體以使瓶?jì)人�體均質(zhì)。
1.2.4 滅活光合細菌溶液的準備
將相應濃度的光合細菌溶液在80 ℃水浴條件下進(jìn)行滅菌15 min后，冷卻使用。
1.2.5 水樣的固定及溶解氧的測定
分別進(jìn)行了1、3、5、6和7 h的光照培養時(shí)間后，立刻進(jìn)行黑白瓶水樣的溶解氧測定，具體方法參照GB 7489—87。
2 結果與分析
2.1 光照培養時(shí)間對測定方法的影響
試驗考察了不同光照時(shí)間1、3、5、6和7 h對添加10 mg/l光合細菌組溶氧（DO）值的影響情況，具體情況如圖1所示。從圖1可以看出，加菌組與對照組的起始DO值相差不大，經(jīng)1 h光照處理后，加菌組的DO增加幅度明顯比對照組的大；而光照培養3 h后，對照組與加菌組的DO值相近；但光照培養超過(guò)5 h后，加菌組的DO值則明顯低于對照組。
 
由此可知,添加光合細菌到水樣中對于水體產(chǎn)氧,即初級生產(chǎn)力確有一定影響,具體表現為：培養時(shí)間較短,低于3 h時(shí),水體產(chǎn)氧有所增加;而超過(guò)3 h后,光合細菌添加組溶氧量降低。值得提出的是,當光照培養時(shí)間超過(guò)6 h后,如達7 h時(shí),水體產(chǎn)氧變化幅度不再增加,如圖1。因此說(shuō),本實(shí)驗評價(jià)方法至少需要光照培養3 h以上;考慮到實(shí)驗組與對照組的差異,實(shí)際進(jìn)行實(shí)驗時(shí)應當選擇光照培養時(shí)間為6 h左右為宜。
2.2 光合細菌濃度對實(shí)驗評價(jià)方法的影響（見(jiàn)圖2）
 
圖2所示為以光照培養時(shí)間為6 h時(shí)的光合細菌濃度對實(shí)驗評價(jià)方法的影響。從圖2可以看出，光照培養6 h時(shí)，各水體DO值達14 mg/l以上；光照培養時(shí)間不超過(guò)6 h，對照組DO增加值為12.97 mg/l，光合細菌添加量為10 mg/l的加菌組DO增加值為11.98 mg/l，大于光合細菌添加量為100 mg/l的加菌組DO增加值10.10 mg/l；2組不同濃度的加菌組DO值增幅均較對照組的小，即添加光合細菌后水體產(chǎn)氧能力均會(huì )下降。
2.3 滅活光合細菌對實(shí)驗方法的影響
因光合細菌使用時(shí)與培養基伴隨存在，故有必要探討光合細菌培養基成分對實(shí)驗評價(jià)方法的影響。圖3所示為直接添加了滅活光合細菌產(chǎn)品的實(shí)驗情況，可以看出,添加滅活光合細菌10 mg/l及100 mg/l的實(shí)驗組與對照組的溶氧值增幅相近,如對照組DO增加值為11.12 mg/l,而加菌組增加值為11.34 mg/l，相差0.22 mg/l。由此可見(jiàn)，添加滅活光合細菌產(chǎn)品對水樣DO值影響極小，即光合細菌培養基對實(shí)驗方法的影響可以忽略不計，只考慮光合細菌本身的作用。
2.4 不同光合細菌調水效果的評價(jià)
應用本方法分別比較了光合細菌A（莢膜紅光合細菌）、光合細菌B（沼澤紅假單胞菌）和光合細菌C（市場(chǎng)采樣）這3種不同光合細菌產(chǎn)品調水作用情況，結果如圖4所示。由圖4可以看出，不同加菌組的產(chǎn)氧變化斜率均小于對照組，即不同加菌組DO值的增加幅度都比對照組小，這進(jìn)一步驗證了添加光合細菌產(chǎn)品后會(huì )降低水體DO值的情況；而不同加菌組DO值的增加幅度會(huì )有所不同，在6 h時(shí)菌C的溶氧量最低，菌A較高，菌B最高，說(shuō)明不同的光合細菌調水作用效果確實(shí)存在一定差異，這說(shuō)明菌C的調水作用相對最大，菌A次之，菌B相對影響較小。
 
 
3 討論
由于光合細菌等微生態(tài)制劑在實(shí)際養殖水體中的調水作用最終會(huì )表現為水體溶解氧水平的變化，因此，從理論上講，采用黑白瓶測氧法應該能夠定性反映出光合細菌等微生態(tài)制劑產(chǎn)品調水作用的大小。就此而言，建立實(shí)驗室條件下評價(jià)光合細菌等微生態(tài)制劑調水作用效果的有效方法是可行的。本實(shí)驗主要采集透明度不低于20 cm的養殖池塘水體，分別考察了光照培養時(shí)間、光合細菌添加量（10和100 mg/l）及光合細菌產(chǎn)品滅活后對于黑白瓶實(shí)驗評價(jià)方法的影響情況。
3.1 關(guān)于光照培養時(shí)間
就光照培養時(shí)間而言，添加光合細菌處理后養殖池塘水體溶解氧值總體表現出下降趨勢，這可能是因為光合細菌兼性營(yíng)養生長(cháng)所致，即在自然光照條件下，光合細菌基本適應環(huán)境后會(huì )與水中藻類(lèi)競爭營(yíng)養鹽，從而造成藻類(lèi)的光合作用一定程度下降，則表現出水體溶解氧水平下降的現象。這與李長(cháng)慧報告中指出多個(gè)在水池水質(zhì)凈化中的試驗都表明了光合細菌具有類(lèi)似作用結果一致。實(shí)驗中表現出的光照培養3 h前，水體溶解氧水平上升，可能是光合細菌處理后，其中的營(yíng)養鹽對于藻類(lèi)有一定的刺激作用，使得藻類(lèi)光合作用強度短暫增加。而超過(guò)6 h以后，光照培養時(shí)間過(guò)長(cháng)，光合細菌生長(cháng)受到一定程度的抑制，則對于藻類(lèi)光合作用的影響減弱。因此說(shuō)，光照培養時(shí)間的選擇對于實(shí)驗評價(jià)方法十分關(guān)鍵。后期不斷重復的實(shí)驗結果也表現出，6 h的光照培養時(shí)間下，光合細菌的影響作用表現相對比較穩定。
3.2 關(guān)于光合細菌的添加濃度
良好實(shí)驗評價(jià)方法的靈敏度情況十分重要。就本方法而言，光合細菌的添加濃度對于實(shí)驗結果表現十分重要。盡管實(shí)際養殖生產(chǎn)中，光合細菌的施用濃度一般在1~2 mg/l左右，這主要是基于使用成本考慮。而本研究前期進(jìn)行的預備實(shí)驗中，采用1 mg/l的光合細菌添加實(shí)驗得出的結果與對照組相比差異不顯著(zhù)。另一方面，本實(shí)驗同期正在進(jìn)行的大塘養殖實(shí)驗表明，光合細菌添加量必須加大，其效果才比較顯著(zhù)，因此本試驗選擇10和100 mg/l兩個(gè)濃度考察對于實(shí)驗方法的影響情況。相比較而言，100 mg/l的影響作用更大，但考慮到光合細菌添加濃度太大，與實(shí)際使用情況相差較遠，應用成本太高，且對于水體營(yíng)養鹽成分改變較大，所以本實(shí)驗選擇光合細菌添加量以10 mg/l為宜。
黑白瓶測氧法是評價(jià)光合細菌調水作用效果的理論基礎，應用碘量法測定水體溶解氧還必須考慮實(shí)際溶解氧濃度的影響，即水樣中的溶解氧水平要在0.2 mg/l和溶解氧飽和濃度的2倍（約20 mg/l）之間，否則必然會(huì )影響到實(shí)驗評價(jià)結果。這些也限制了光照培養時(shí)間或光合細菌的添加濃度等。實(shí)際實(shí)驗中，如果采用的水樣藻類(lèi)過(guò)濃，則水樣必須進(jìn)行稀釋后，使透明度為20 cm左右才行。
3.3 關(guān)于溶解氧測定方法
值得提出的是，當光照培養時(shí)間過(guò)長(cháng)或水體過(guò)肥，或光合細菌添加量太大時(shí)，培養水體的溶解氧水平過(guò)高，則必須考慮到溶解氧測定步驟中后期酸化水樣中加酸量對測定結果的影響。實(shí)際考察了溶解氧含量過(guò)高（超過(guò)15 mg/l以上）時(shí)，加酸量對于溶解氧測定值的影響情況，如圖5所示�？梢钥闯�，隨著(zhù)加酸量的增加，水樣中的溶氧量測定值逐漸增加，直至趨于穩定。這也說(shuō)明，只有加酸量達到一定量后，所測定水樣中的溶解氧測定值才會(huì )達到穩定。因此，實(shí)際操作中其加酸量不能太少。但加酸量過(guò)大時(shí)會(huì )影響水樣原體積，從而影響實(shí)驗結果。
 
3.4 其它影響因素
最后，光照強度也是本實(shí)驗方法必須考慮的重要因素。當光強度過(guò)低時(shí)，如陰雨天氣會(huì )導致實(shí)驗效果不明顯。另外，水樣中含有氧化性物質(zhì)或懸浮物及較多亞硝酸鹽氮和亞鐵離子等都是碘量法測氧本身的缺陷，這些對于本實(shí)驗方法當然會(huì )有一定影響。
初步基于以上幾種因素建立的本實(shí)驗方法，進(jìn)行市場(chǎng)上幾種調水用光合細菌的效果評價(jià)。結果得出，以透明度不低于20 cm的養殖用水，在光照培養時(shí)間為6 h，光合細菌添加濃度為10 mg/l的實(shí)驗條件下，添加光合細菌會(huì )使得水體溶解氧水平降低10%~15%左右。就光合細菌A、B和C 3種產(chǎn)品而言，產(chǎn)品C使得溶解氧水平下降幅度最大，達15%左右，則實(shí)際應用中，可作為有限考慮使用的產(chǎn)品。
4 結論
本研究表明，在一定條件下本實(shí)驗方法可以作為評價(jià)微生態(tài)制劑改良水質(zhì)的有效依據。與現有評價(jià)方法相比，本實(shí)驗方法簡(jiǎn)單、過(guò)程操作可行，可作為調水用光合細菌產(chǎn)品研發(fā)公司菌種篩選提供一種簡(jiǎn)便的實(shí)驗室評價(jià)方法。

 

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