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了解原生質(zhì)體融合技術(shù)的原理。
學(xué)習并掌握以細菌為材料的原生質(zhì)體融合技術(shù)。
二、實(shí)驗原理
原核微生物基因重組主要可通過(guò)轉化、轉導、接合等途徑，但有些微生物不適于采用這些途徑，從而使育種工作受到一定的限制。1978 年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì )上，有人提出微生物細胞原生質(zhì)體融合這一新的基因重組手段。由于它具有許多特殊優(yōu)點(diǎn)，所以，目前已為國內外微生物育種工作所廣泛研究和應用。
(一)、原生質(zhì)體融合的優(yōu)點(diǎn)
(1)、克服種屬間雜交的“不育性”，可以進(jìn)行遠緣雜交。由于用酶解除去細胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同種屬間的微生物，皆可發(fā)生原生質(zhì)體融合，產(chǎn)生重組子。
(2)、基因重組頻率高，重組類(lèi)型多。原生質(zhì)體融合時(shí)，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使細胞相互聚集，可以提高基因重組率。原生質(zhì)體融合后，兩個(gè)親株的整套基因組 (包括細胞核、細胞質(zhì))相互接觸，發(fā)生多位點(diǎn)的交換，從而產(chǎn)生各種各樣的基因組合，獲得多種類(lèi)型的重組子。
(3) 可將由其他育種方法獲得的優(yōu)良性狀，經(jīng)原生質(zhì)體融合而組合到一個(gè)菌株中。
(4) 存在著(zhù)兩個(gè)以上親株同時(shí)參與融合，可形成多種性狀的融合子。
(二)、原生質(zhì)體融合步驟
(1)、選擇親本 選擇兩個(gè)具有育種價(jià)值并帶有選擇性遺傳標記的菌株作為親本。
(2)、制備原生質(zhì)體 經(jīng)溶菌酶除去細胞壁，釋放出原生質(zhì)體，并置高滲液中維持其穩定。
(3)、促融合 聚乙二醇加入到原生質(zhì)體以促進(jìn)融合。聚乙二醇為一種表面活性劑，能強制性的促進(jìn)原生質(zhì)體融合。在有Ca2+ 、Mg2+離子存在時(shí)，更能促進(jìn)融合。
(4)、原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體已失去細胞壁，雖有生物活性，但在普通培養基上不生長(cháng)，必須涂布在再生培養基上，使之再生。
(5)、檢出融合子 利用選擇培養基上的遺傳標記，確定是否為融合子。
(6)、融合子篩選 產(chǎn)生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類(lèi)型，前者性能不穩定，要選出性能穩定的單倍重組體，反復篩選出生產(chǎn)性能良好的融合子。
(三)、 原生質(zhì)體再生率和融合率計算
三、實(shí)驗材料
(一)、 菌種：
枯草芽孢桿菌T4412 ade- his-、枯草芽孢桿菌TT2 ade-pro-
(二)、 培養基(配制方法見(jiàn)下一頁(yè)附錄)：
(1)、完全培養基(CM，液體)；
(2)、完全培養基(CM，固體) 液體培養基中加入2.0%瓊脂；
(3)、基本培養基(MM)；
(4)、補充基本培養基(SM) 在基本培養基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的純化瓊脂，75 Pa 滅菌20min；
(5)、再生補充基本培養基(SMR) 在補充基本培養基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％純化瓊脂作上層平板，2.0％純化瓊脂作底層平板、75 Pa 滅菌20 min。
(6)、酪蛋白培養基(測蛋白酶活性用)。
(三)、 緩沖液：
(1)、 0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液。
(2)、高滲緩沖液：于上述緩沖液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四)、 原生質(zhì)體穩定液(SMM)：
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸，調pH 6.5。
(五)、 促融合劑：
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六)、 溶菌酶液：
酶粉酶活為4000 u/g，用SMM 溶液配制，終濃度為2 mg/mL，過(guò)濾除菌備用。
(七)、器皿：
養皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、臺式離心機、721 比色計、細菌過(guò)濾器。
四、實(shí)驗步驟
(一)、 原生質(zhì)體的制備：
1、培養枯草芽孢桿菌：
取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環(huán)到裝有液體完全培養基(CM)的試管中，36℃振蕩培養14 h，各取1 mL 菌液轉接入裝有20 mL 液體完全培養基的250 mL 錐形瓶中，36℃振蕩培養 3 h，使細胞生長(cháng)進(jìn)入對數前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其終濃度為0.3 u/mL，繼續振蕩培養2 h。
2、收集細胞：
各取菌液10 mL，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，將菌體懸浮于磷酸緩沖液中，離心。如此洗滌兩次，將菌體懸浮10 mL SMM 中，每mL 約含108～109 活菌為宜。
3、總菌數測定：
各取菌液0.5 mL，用生理鹽水稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US>10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀釋度作兩個(gè)平板)、傾注完全培養基，36℃培養24 h 后計數。此為未經(jīng)酶處理的總菌數。
4、脫壁：
二株親本菌株各取5 mL 菌懸液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶濃度為100 ug/mL，混勻后于36℃水浴保溫處理30 min，定時(shí)取樣，鏡檢觀(guān)察原生質(zhì)體形成情況，當95%以上細胞變成球狀原生質(zhì)體時(shí)，用4000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質(zhì)體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中。立即進(jìn)行剩余菌數的測定。
5、剩余菌數測定：
取0.5 mL 上述原生質(zhì)體懸液，用無(wú)菌水稀釋?zhuān)乖|(zhì)體裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL，涂布于完全培養基平板上，36℃培養24～48 h，生長(cháng)出的菌落應是未被酶裂解的剩余細胞。
計算酶處理后剩余細胞數，并分別計算二親株的原生質(zhì)體形成率。原生質(zhì)體形成率＝未經(jīng)酶處理的總菌數一酶處理后剩余細胞數
(二)、 原生質(zhì)體再生：
用雙層培養法，先倒再生補充基本固體培養基(SMR)作底層，取0.5 mL 原生質(zhì)體懸液，用SMM作適當稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US>10-3、10-4、10-5 稀釋液各1mL，加入底層平板培養基的中央，再倒入上層再生補充半固體培養基混勻，36℃培養48 h。分別計算二親株的原生質(zhì)體的再生率，并計算其平均數。
(三)、 原生質(zhì)體融合：
取兩個(gè)親本的原生質(zhì)體懸液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 離心10 min，棄上清液。于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混勻，再加入1.8 mL PEG 溶液，輕輕搖勻，置36℃水浴保溫處理2 min，2500 r/min 離心10 min，收集菌體，將沉淀充分懸浮于2 mL SMM 液中。
(四)、 檢出融合子：
取0.5 mL 融合液，用SMM 液作適當稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US>0.1 mL 菌液與滅菌并冷卻至50℃的再生補充基本培養基軟瓊脂中混勻，迅速傾入底層為再生補充基本培養基的平板上，36℃培養2 d，撿出融合子，轉接傳代，并進(jìn)行計數，計算融合率。
(五)、 融合子的篩選：
挑選遺傳標記穩定的融合子，凡是在再生補充基本培養基平板上長(cháng)出的菌落，初步認為是融合子，可接入到酪蛋白培養基平板上，再挑選蛋白酶活性高于親本的融合子。由于原生質(zhì)體融合后會(huì )出現兩種情況：一種是真正的融合，即產(chǎn)生雜核二倍體或單倍重組體，另一種只發(fā)生質(zhì)配，而無(wú)核配，形成異核體。兩者都能在再生基本培養基平板上形成菌落，但前者穩定，而后者則不穩定。故在傳代中將會(huì )分離為親本類(lèi)型。所以要獲得真正融合子，必須進(jìn)行幾代的分離、純化和選擇。
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