免疫血清對旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)侵入腸上皮細胞及其發(fā)育的影響

旋毛蟲(chóng)成囊期幼蟲(chóng)經(jīng)口感染宿主后，在胃液和腸液的消化作用下，幼蟲(chóng)在十二指腸自囊包內逸出，侵入十二指腸及空腸上部粘膜的多細胞內龕（intramulticellular niche）中，經(jīng)29～36 h 完成4 次蛻皮后發(fā)育為成蟲(chóng)[1]。小腸粘膜是旋毛蟲(chóng)感染宿主后的第一道天然屏障，如大鼠初次感染旋毛蟲(chóng)后有20%~30%的蟲(chóng)體在感染后24 h 從腸道中排出稱(chēng)為排蟲(chóng)反應（wormexpulsion）或快速排蟲(chóng)（rapid expulsion）[2]，而有免疫力的大鼠或小鼠再次感染后的排蟲(chóng)率為74%~99%；對感染旋毛蟲(chóng)的母鼠所產(chǎn)仔鼠（出生后14 和21 d）攻擊感染旋毛蟲(chóng)后18 h的排蟲(chóng)率分別達97.5%、91%[3]。因此，旋毛蟲(chóng)脫囊幼蟲(chóng)侵入小腸粘膜內繼續發(fā)育或是被宿主從腸道中排出，是旋毛蟲(chóng)能否導致感染與致病的關(guān)鍵步驟。由于不能在體外觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵入腸上皮細胞或腸道排蟲(chóng)反應的過(guò)程，目前關(guān)于幼蟲(chóng)對腸粘膜的侵入或排出反應的機制均不完全清楚[4]。本文將旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)與HCT-8 腸上皮細胞在體外共培養，觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)排泄分泌（excretory-secretory，ES）抗原或表面抗原（surface antigens）免疫鼠血清對幼蟲(chóng)侵入腸上皮細胞及發(fā)育的影響。
　　　　1 材料
　　　　1.1 旋毛蟲(chóng)、實(shí)驗動(dòng)物和細胞株
　　旋毛蟲(chóng)為河南省南陽(yáng)豬源旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis)，由本室昆明小鼠傳代保種。雄性6 周齡昆明小鼠（清潔級）和雄性6 周齡BALB/c 鼠（SPF 級），體重20~25 g，均購自鄭州大學(xué)醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心。人結腸癌細胞系（human colonic carcinoma cell line-8，HCT-8）購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。HCT-8 細胞接種于1640 完全培養基中，37 ℃ 5% CO₂ 培養箱中培養。
　　
　　1.2 主要儀器和試劑
　　人工消化液（含1%胃蛋白酶、0.7%鹽酸和0.85%氯化鈉），1640 完全培養基含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，上海尚寶公司生物科技有限公司）、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素，半固體培養基（含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基+1.75%低熔點(diǎn)瓊脂糖），FITC 標記的羊抗鼠IgG 均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡（IX71）和熒光顯微鏡（BX51）均為日本奧林巴斯產(chǎn)品。
　　
　　2 方法
　　
　　2.1 肌幼蟲(chóng)的收集
　　50 只昆明小鼠經(jīng)口感染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)（300 條/鼠）42 d 后拉頸處死。膈肌壓片鏡檢證實(shí)感染成功后，剝皮、除內臟和脂肪，用攪拌器攪碎小鼠骨骼肌。將肌肉與人工消化液按1g∶10 ml 混合后置于42 ℃震蕩消化4 h，按貝氏法收集肌幼蟲(chóng)，生理鹽水反復洗滌后鏡下計數備用[5] 。
　　
　　2.2 ES 抗原與表面抗原免疫血清的制備
　　ES 抗原與表面抗原的制備分別參照文獻[6,7]操作，考馬斯亮藍測定ES 抗原和表面抗原蛋白濃度分別為1.26 mg/ml 與0.86 mg/ml。將ES 抗原與福氏完全佐劑1：1 混合后，皮下注射免疫10 只BALB/c 小鼠，間隔10d 后再用ES 抗原與福氏不完全佐劑1：1 混合后皮下注射免疫第2 次，間隔10 d 第3 次皮下注射免疫，于免疫后1 周尾靜脈采血，分離血清，采用ELISA 法測定血清抗體滴度，當滴度達10⁴ 以上時(shí)，于第3 次免疫后10d 皮下注射加強免疫1 次，1 周后眶竇靜脈采血，分離血清。表面抗原免疫血清的制備方法同ES 抗原免疫血清，ES 抗原與表面抗原每次免疫小鼠的劑量均為20μg/只。ELISA 檢測ES 抗原、表面抗原免疫鼠血清抗體滴度分別5×10⁵ 與1×10⁵。
　　
　　2.3 旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的激活
　　將旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)用含5%牛膽汁的無(wú)菌生理鹽水在37℃ 5% CO2 條件下孵育2h，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次后，加入含抗生素的生理鹽水（100 U/ml 青霉素，100 μg/ml 鏈霉素）中37 ℃孵育1 h，備用[8]。
　　
　　2.4 幼蟲(chóng)在腸上皮細胞單層中發(fā)育情況的觀(guān)察
　　將 HCT-8 細胞以1×10⁶/孔的密度接種至含完全培養基的6 孔培養板中，37 ℃ 5% CO2培養24 h，鏡下觀(guān)察HCT-8 細胞貼壁生長(cháng)至成致密的單細胞層。將激活后的幼蟲(chóng)加入半固體培養基中，然后覆蓋到HCT-8 細胞單層，37℃ 5% CO₂ 培養，分別在12、18、24、36、72 和96 h 時(shí)鏡下觀(guān)察幼蟲(chóng)的蛻皮及發(fā)育情況。
　　
　　2.5 免疫血清對幼蟲(chóng)侵入腸上皮細胞及發(fā)育的影響
　　將 200μlES 抗原或表面抗原免疫鼠血清與1800μl半固體培養基充分混合后加入約100條激活后的幼蟲(chóng)，然后覆蓋到培養HCT-8 細胞的6 孔板的其中1 孔中，分別接種4 孔，37 ℃5% CO2 培養15 min，觀(guān)察幼蟲(chóng)的發(fā)育情況及形態(tài)，培養36 h 后鏡下觀(guān)察并計數1 期（未蛻皮的幼蟲(chóng)）及2~4 期幼蟲(chóng)數（蛻皮1 次及1 次以上的幼蟲(chóng)）。設感染旋毛蟲(chóng)小鼠血清和正常鼠血清為對照組。
　　
　　2.6 間接熒光抗體試驗對幼蟲(chóng)蛻皮情況的觀(guān)察
　　收集方法 2.5 中培養36 h 的幼蟲(chóng)，采用試管法進(jìn)行間接熒光抗體試驗（IFAT）[9]，即將收集的幼蟲(chóng)置于1.5 ml 離心管中，加入1 ml 冷丙酮固定10 min；加入表面抗原免疫鼠血清（用0.01 mol/L pH 8.0 的PBS 1：10 稀釋?zhuān)��?st1:chmetcnv w:st="on" TCSC="0" NumberType="1" Negative="False" HasSpace="True" SourceValue="37" UnitName="℃">37 ℃孵育30 min、PBS 洗滌3 次；加入用0.01mol/L pH 8.0 的PBS 1：30 稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG，并加入0.01%的伊文思藍，37 ℃孵育30 min、PBS 洗滌3 次；將幼蟲(chóng)轉移至載玻片上，滴加一滴緩沖甘油，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀(guān)察。蛻皮的幼蟲(chóng)無(wú)綠色熒光或僅有微弱的熒光，未蛻皮幼蟲(chóng)顯示明亮的綠色熒光，分別計數1 期及2~4 期幼蟲(chóng)數。設旋毛蟲(chóng)感染小鼠陽(yáng)性血清對照、正常小鼠血清陰性對照和PBS 空白對照。
　　
　　2.7 統計學(xué)分析
　　采用 SPSS16.0 對實(shí)驗數據進(jìn)行處理，旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)數用均數±標準差表示。應用卡方檢驗對數據進(jìn)行分析。
　　
　　3 結果
　　
　　3.1 幼蟲(chóng)在腸上皮細胞單層中的發(fā)育情況
　　培養 12 h 時(shí)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)已侵入HCT-8 細胞單層并在其中移行；18 h 在幼蟲(chóng)尾端可見(jiàn)鞘的形成，頭端未發(fā)現帽樣結構；24 h 可見(jiàn)幼蟲(chóng)部分蛻皮；36 h 幼蟲(chóng)蛻皮1 次；72 h 可見(jiàn)幼蟲(chóng)第2 次蛻皮；96 h 可見(jiàn)到早期成蟲(chóng)，在雄成蟲(chóng)尾端能夠看到交配附器。
　　
　　3.2 免疫血清對幼蟲(chóng)侵入腸上皮細胞的影響
　　旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在含ES 抗原或表面抗原免疫血清的半固體培養基+HCT-8 細胞培養15 min后，發(fā)現ES 免疫血清組的部分幼蟲(chóng)頭端有帽樣結構形成，旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清對照組部分幼蟲(chóng)頭端也有帽樣結構；帽樣結構與幼蟲(chóng)頭端緊密相連。表面抗原免疫血清組、正常小鼠血清對照組的幼蟲(chóng)均未觀(guān)察到帽樣結構。少數帶有頭端帽樣結構的幼蟲(chóng)可移行到細胞單層表面，多數仍停留在半固體培養基中，但均不能侵入HCT-8 細胞單層中。培養12 h~36h 時(shí)可見(jiàn)蟲(chóng)體的尾端或者頭端脫鞘，但蟲(chóng)體不能從鞘中脫出。
　　
　　3.3 免疫血清對幼蟲(chóng)發(fā)育的影響
　　由于旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)表面抗原具有期特異性，蛻皮的幼蟲(chóng)無(wú)綠色熒光或僅有微弱的熒光，未蛻皮幼蟲(chóng)則顯示明亮的綠色熒光。幼蟲(chóng)在含4 種血清的半固體培養基+HCT-8 細胞中發(fā)育至2~4 期幼蟲(chóng)百分比的差異有統計學(xué)意義（χ2=178.3，P<0.05），在含旋毛蟲(chóng)感染鼠血清、ES 抗原及表面抗原免疫鼠血清條件下發(fā)育至2-4 期幼蟲(chóng)的百分比分別為1.17%、2.25%、2.2%，均低于含正常鼠血清條件下24.74%的百分比（χ12=77.6，χ22=74.6，χ32=66.9，P<0.05），但在感染鼠血清、ES 抗原及表面抗原免疫鼠血清條件下發(fā)育至2-4 期幼蟲(chóng)百分比的差異無(wú)統計學(xué)意義（χ2=2.14，P>0.05）。
　　
　　4 討論
　　
　　人結直腸癌細胞系-8（human coloniccarcinoma cell line-8，HCT-8），也稱(chēng)為人回肓腸上皮細胞系-8（human ileocecal epithelial cell line-8），培養成熟的HCT-8 細胞形態(tài)和功能與小腸上皮細胞類(lèi)似，國內外主要用于藥物吸收、結腸癌耐藥機制等研究。近年來(lái)有人將HCT-8細胞成功地用于腸道內寄生原蟲(chóng)-隱孢子蟲(chóng)的體外培養[10-11]及抗隱孢子蟲(chóng)藥物的體外篩選[12]。本文模擬旋毛蟲(chóng)感染宿主后的腸道內環(huán)境，觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在HCT-8 細胞中的發(fā)育情況,結果表明HCT-8 細胞能夠維持旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在體外的發(fā)育，可作為體外研究旋毛蟲(chóng)侵入機制及篩選抗旋毛蟲(chóng)藥物的細胞系。
　　感染性幼蟲(chóng)在含感染鼠血清或ES 抗原免疫血清的培養基中培養15 min 后，發(fā)現部分幼蟲(chóng)頭端有帽樣結構形成，表明幼蟲(chóng)頭端的帽樣結構是由幼蟲(chóng)口孔分泌的ES 抗原與感染血清或ES 抗原免疫血清中的抗體形成的免疫復合物，提示旋毛蟲(chóng)ES 抗原中可能存在有幼蟲(chóng)侵入腸上皮細胞的相關(guān)因子。由于旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)的口孔無(wú)齒狀和矛狀結構，幼蟲(chóng)并不能侵入所有的細胞系（如人肺成纖維細胞WI-38、小鼠橫紋肌成肌細胞C2C12 及大鼠空腸隱窩細胞IEC-6 等）[8]，故幼蟲(chóng)對腸上皮細胞的侵入可能不是簡(jiǎn)單的機械性損傷，而可能是通過(guò)幼蟲(chóng)分泌的某種蛋白或宿主細胞釋放的某些化學(xué)信號介導的[13]。本研究觀(guān)察到的帶有頭端帽樣結構的幼蟲(chóng)不能侵入到細胞單層中，表明幼蟲(chóng)頭端的帽樣結構可阻止幼蟲(chóng)對腸上皮細胞的侵入，其機制可能與帽樣結構阻止了幼蟲(chóng)感覺(jué)器官對細胞信號的接收有關(guān)[14]。McVay[15]等將針對旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)表面與分泌蛋白中泰威糖（tyvesole）抗原的單抗加入培養的犬腎上皮細胞MDCK-AA7 中，發(fā)現高濃度的單抗可完全阻止幼蟲(chóng)對上皮細胞的侵入，而低濃度的單抗雖然不能阻止幼蟲(chóng)的侵入，但可將幼蟲(chóng)包裹在細胞單層中，阻止幼蟲(chóng)的移行與蛻皮[16]。本研究將ES 抗原及表面抗原免疫血清按1：10 加入半固體培養基+HCT-8 細胞培養36 h，發(fā)現發(fā)育至2-4 期幼蟲(chóng)的百分比（2.25%及2.2%）均明顯低于含正常鼠血清條件下培養的幼蟲(chóng)（24.74%），表明兩種免疫血清均可阻止部分幼蟲(chóng)的蛻皮及發(fā)育。

　　
　　[參考文獻] (略)
　　

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