抗豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體（PEDV-IgY）及其特性研究

摘要:  豬流行性腹瀉病毒(PEDV)分離株在仔豬腸道內增殖后收獲小腸組織提純并濃縮病毒,與弗氏佐劑乳化后免疫待開(kāi)產(chǎn)蛋雞；同時(shí)將在Vero細胞中適應增殖的PEDV病毒提純濃縮后作為檢測抗原。利用瓊脂擴散試驗檢測免疫雞的血清抗體和卵黃抗體效價(jià)變化動(dòng)態(tài),結果顯示血清抗體較卵黃抗體出現早，提前1周到達峰值，同時(shí)其抗體效價(jià)下降也快。將抗體效價(jià)≥1:64的卵黃收集,經(jīng)氯仿抽提和硫酸胺沉淀后制備提純卵黃抗體液，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示該提純卵黃抗體主要由分子量分別為66kd的重鏈和35kd的輕鏈組成。攻毒治療試驗結果顯示卵黃抗體治療組和對照組死亡率分別為16.7%和100%，表明該卵黃抗體對豬流行性腹瀉病毒所致的仔豬腹瀉具有明顯的治療效果。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒（PEDV）, 卵黃抗體（IgY），仔豬腹瀉

 豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）為冠狀病毒科的成員，與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染引起的臨床癥狀和病理變化極為相似，該病原可致各種年齡的豬發(fā)病，其特征癥狀為嘔吐、腹瀉和脫水，本病呈地方流行性，仔豬有較高的發(fā)病率和死亡率，給某些養豬場(chǎng)豬場(chǎng)帶來(lái)嚴重經(jīng)濟損失[1]。

對曾發(fā)生過(guò)該病的豬場(chǎng)或接種過(guò)PEDV弱毒疫苗的妊娠母豬，仔豬主要通過(guò)初乳獲得對PEDV的抵抗力，母源抗體消失后的斷奶仔豬常出現頑固性腹瀉，而一旦暴發(fā)豬流行性腹瀉，目前尚沒(méi)有特別有效的防治措施。鑒于卵黃抗體與初乳作用機理相似，都是通過(guò)被動(dòng)免疫途徑達到對仔豬的保護，因而研制抗PEDV卵黃抗體[2]，應用于發(fā)生PED的豬場(chǎng)，對防止PED的流行及降低該病造成的損失將具有重要意義。

本試驗利用一株豬流行性腹瀉病毒分離株，制備免疫原免疫產(chǎn)蛋雞，收集高效價(jià)卵黃，分離提純卵黃抗體，用于PED的治療和預防，從而為防治PED研制一種療效顯著(zhù)、使用方便、易于大量獲得且無(wú)環(huán)境污染的生物制劑。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒和細胞   豬流行性腹瀉病毒分離株來(lái)自中國農業(yè)大學(xué)獸醫學(xué)院；增殖病毒用Vero細胞，由本室保存。

1.1.2試驗試劑    培養細胞用培養基和血清購自GIBCO BRL公司；弗氏佐劑購自中國獸藥監察所。

1.1.3試驗動(dòng)物    120日齡待開(kāi)產(chǎn)非免疫蛋雞,購自中國獸藥監察所；1日齡未吃初乳仔豬購自京郊某豬場(chǎng)。

1.2方法

1.2.1PEDV在豬體內增殖   1日齡未吃初乳仔豬人工哺乳，PEDV口服攻毒，出現腹瀉24小時(shí)后剖殺，取小腸組織用于提取和純化PEDV。

1.2.2PEDV提取與純化   刮取小腸內壁組織及內容物充分研磨，加10倍體積PBS稀釋?zhuān)�反復凍�?SPAN lang=EN-US>3次后離心，取上清液用PEG6000進(jìn)行純化并濃縮，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后即為提純PEDV[3]。

1.2.3 PEDV在細胞上增殖   培養Vero細胞，細胞單層長(cháng)至75%以上時(shí)，接種提純PEDV并加入50μg/mL胰酶以助病毒吸附，若72小時(shí)后細胞病變(CPE)不明顯，則收獲細胞盲傳下1代，盲傳至第5代出現CPE，此時(shí)收獲病變細胞，反復凍融3次后離心取上清液，最后對病毒上清液進(jìn)行濃縮備用[2，4，5]。

1.2.4免疫   濃縮病毒液經(jīng)0.5%甲醛滅活后與等量弗氏佐劑乳化作為免疫原。首免前5日用破傷風(fēng)類(lèi)毒素等混合制劑對每只雞胸肌多點(diǎn)注射0.5mL，以刺激機體免疫反應。首免免疫劑量1mL，胸肌多點(diǎn)注射；分別間隔兩周進(jìn)行二免和三免，免疫劑量增至1.5mL和2mL。

1.2.5抗體效價(jià)檢測    二免后1周開(kāi)始，每周采血和收集卵黃，應用瓊脂擴散試驗檢測血清抗體和卵黃抗體效價(jià)，比較二者的變化動(dòng)態(tài)，至卵黃抗體效價(jià)達到1∶64時(shí)收集卵黃。

1.2.6卵黃抗體提純    無(wú)菌收集高效價(jià)卵黃，先后加入2倍體積生理鹽水和1/2體積氯仿充分振蕩，離心后收集上清液，先后用50%和36%硫酸胺沉淀卵黃抗體，最后溶于與原卵黃量等體積的生理鹽水中，4℃透析24小時(shí)，即為提純卵黃抗體。

1.2.7提純卵黃抗體檢測    應用BCA Protein Assay Kit（購自Pierce公司）測定卵黃抗體的蛋白濃度；卵黃抗體純度通過(guò)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測；而卵黃抗體的效價(jià)用瓊脂擴散試驗檢測。

1.2.8卵黃抗體抗病毒活性測定   剛出生未吃初乳仔豬18頭，采用人工哺乳，隨機分成兩組，治療組12頭，對照組6頭，適應24小時(shí)后攻毒，仔豬開(kāi)始出現腹瀉時(shí)治療組口服提純卵黃抗體液，每豬每次2ml，每日3次；對照組口服等量生理鹽水。逐日觀(guān)察，以糞便指數和死亡率兩個(gè)指標反映治療組和對照組差異是否顯著(zhù)。糞便指數按照Sherman等[6]制定的標準判定，即0分為正常，糞便固態(tài)成形；1分為輕度腹瀉，糞便稀軟成形；2分為中度腹瀉，糞便呈黃色水樣；3分為重度腹瀉，糞便呈水樣噴射。

2結果

2.1血清抗體和卵黃抗體效價(jià)檢測    結果顯示，二免后1周血清抗體較卵黃抗體效價(jià)高，血清抗體效價(jià)上升快，至三免后2周達到峰值，之后其效價(jià)快速下降；而卵黃抗體效價(jià)上升較慢，三免后3周達到峰值，之后其效價(jià)緩慢下降，較血清抗體維持2.2卵黃抗體濃度、純度和效價(jià)測定    卵黃經(jīng)氯仿去脂后蛋白濃度為14.5mg/mL ,經(jīng)硫酸胺沉淀并透析后蛋白濃度為10.2mg/mL;SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳(圖2)顯示不同方法處理后卵黃抗體純度明顯提高，卵黃抗體由分子量約為66kd和35kd的重鏈和輕鏈組成，與文獻報道一致[7]；氯仿去脂后瓊擴效價(jià)為1∶8，而透析后上升至1∶64。

2.3卵黃抗體抗病毒活性測定    攻毒后12－24小時(shí)所有仔豬均出現不同程度的黃色水瀉，治療組在口服卵黃抗體液后腹瀉癥狀逐漸減輕，4-5天后基本恢復正常，死亡率僅16.7%；而對照組腹瀉呈水樣噴射，死亡主要出現在攻毒后2-3天，死亡率為100%，兩者差異極顯著(zhù)。結果見(jiàn)表1。

表1   仔豬攻毒治療后不同天數死亡情況及糞便指數結果

Tab.1  Comparison of mortality rate and fecal scoring between the IgY treatment group and the control group

注：分母為存活仔豬數，分子為腹瀉仔豬數；括號內為存活仔豬平均糞便指數。

Note: the numerator/denominator means No. of diarrhea piglets/No. of survival piglets; Numbers within parentheses indicate the mean fecal scoring.

3討論

    豬流行性腹瀉病毒感染呈地方流行性，傳播較慢但感染后在養豬場(chǎng)持續存在，仔豬母源抗體消失后即發(fā)病，死亡率較高，同時(shí)排毒和散毒感染陸續出生的仔豬，抗生素治療無(wú)效。本實(shí)驗研制的卵黃抗體經(jīng)口服后在腸道內與PEDV作用，可阻止病毒的吸附和感染，同時(shí)病毒排出體外后失去感染力，對該病流行也有一定的抑制作用。目前國內尚未見(jiàn)針對PEDV卵黃抗體研制的報道。

本試驗采用氯仿去脂和硫酸胺沉淀來(lái)提純卵黃抗體，卵黃經(jīng)氯仿處理后易于去除脂類(lèi)和不溶性蛋白，上清液澄清透明，再利用鹽沉淀可進(jìn)一步提純和濃縮抗體，操作簡(jiǎn)單方便，抗體純度高，缺點(diǎn)是處理樣品量少，氯仿造成環(huán)境污染。

血清抗體和卵黃抗體效價(jià)比較結果顯示，免疫后血清抗體效價(jià)先上升，到達峰值后下降也較快；卵黃抗體效價(jià)上升稍慢，但達到峰值后常維持較長(cháng)時(shí)間，下降也較慢；但血清抗體和卵黃抗體效價(jià)總的變化趨勢是一致的。

卵黃抗體的分子量約為180kd，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，本實(shí)驗蛋白質(zhì)電泳結果顯示兩條蛋白條帶分別為66kd的重鏈和35kd的輕鏈，說(shuō)明我們已提純制備了卵黃抗體。

通過(guò)仔豬攻毒和卵黃抗體治療試驗顯示，口服卵黃抗體的仔豬得到了有效保護，說(shuō)明卵黃抗體具有明顯的抗病毒活性，可以應用于PEDV感染仔豬的治療。

豬場(chǎng)一旦發(fā)生PED，目前尚沒(méi)有特別有效的防治措施，因而該病應以預防為主，在加強養豬場(chǎng)綜合預防措施的同時(shí)，在有豬流行性腹瀉發(fā)病史的豬場(chǎng)，給妊娠母豬注射弱毒疫苗，新生仔豬添加卵黃抗體，對防治該病將具有重要意義。

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