幽門(mén)螺桿菌改良無(wú)血培養基的研制

   An improved medium without blood for Helicobacter pylori

    WANG Yichao,GUO Gang,XIE Qinghua,ZOU Quanming(Department of Clinical Microbiology,Third Military Medical University,Chongqing 400038)

    Abstract Establish a rapid and easy medium without blood for Helicobacter pylori.Improve the components to the brain heart infussion-egg yolk agar medium without blood(BHI-EA).Through isolation and cultivation of the Helicobacter pylori from 82 stomach mucosas with the improved medium and brain heart infusion agar containing blood(BHIA)to compared the difference between this improved medium and BHIA on the positive rate of the stomach mucosas,isolation time and grow speed of pure cultivation.The rate of Helicobacter pylori positive with the improved mediums was 70%(57/82),but with the BHIA was 63%(52/82).The time for pure cultivation could shorten 12 h,isolation shorten 24 h.All the test indexes were typically.The improved medium is easier to isolate and culture Helicobacter pylori.

    Key words Helicobacter pylori； Medium

    Helicobacter pylori(幽門(mén)螺桿菌,Hp)是一種與人類(lèi)消化道疾病密切相關(guān)的病原菌。其體外培養的方法較多［1，3］，國內多采用含血腦心浸液培養基。由于其操作的繁瑣及易污染性，近年來(lái)陸續有人采用無(wú)血培養基即卵黃培養基［4，5］，但該培養基仍存在培養時(shí)間較長(cháng)的缺點(diǎn)。針對此情況，我們在卵黃培養基的基礎上進(jìn)行改良，使培養時(shí)間縮短，且細菌的各種生物學(xué)性狀均較典型。

    1 材料及方法

    1.1 培養基的制備

    1.1.1 含血腦心浸液培養基(BHIA) 取腦心浸液(BHI)［6］45 ml加入蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸餾水 55 ml，調節pH值至7.6～7.8，加瓊脂粉1.5 g后高壓，再加入已滅菌綿羊血5 ml，10 g/dl葡萄糖5 ml和萬(wàn)古霉素、磺胺增效劑(TMP)以及多粘菌素B，使其最終濃度分別達到10 mg/L、5 mg/L、0.38 mg/L，倒平板備用。

    1.1.2 卵黃腦心浸液培養基(BHI-EA) 取新鮮雞蛋于75%酒精內消毒10分鐘，以無(wú)菌手續將卵黃取出放入有玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，使最終體積比為1∶1，搖勻備用。向45 ml牛腦心浸液中加入胰蛋白胨1 g，1 g/dl可溶性淀粉，NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸餾水55 ml，調節pH值為7.6，加瓊脂粉1.5 g高壓，待溫度降至60°C時(shí)加入上述卵黃水30 ml，再加入20 g/dl無(wú)菌葡萄糖溶液3 ml及抗生素混懸液，使最終濃度分別為，萬(wàn)古霉素10 mg/L，TMP 5 mg/L，多粘菌素B 0.38 mg/L，倒平板待用。

    1.2 Hp分離培養 取82例我校附屬醫院消化科胃鏡室就診病人胃粘膜標本，分別置玻璃勻漿器內研磨后，取等量懸液均勻涂布于上述二種培養基上。將各接種平板置于密閉玻璃干燥器內，用抽氣泵抽至負壓73 kPa后，灌入氣體使終濃度分別達到(5% O2、85% N2、10% CO2)，罐內放一盛水小瓶，使濕度＞95%，37°C孵箱內孵育1～4天，觀(guān)察Hp生長(cháng)情況以及檢測生物學(xué)性狀。

    1.3 Hp純培養 取等量已分離純化的Hp菌液轉種到上述兩種培養基上，L型玻璃棒均勻涂布后培養，培養條件同上，觀(guān)察長(cháng)出肉眼可見(jiàn)菌落所需時(shí)間。

    1.4 Hp鑒定 生長(cháng)出的菌株用革蘭染色鏡檢，PCR鑒定，另作脲酶、氧化酶、觸酶及動(dòng)力實(shí)驗對其生物學(xué)性狀進(jìn)行檢測，步驟按常規法進(jìn)行。

    2 結果

    2.1 兩種培養基上胃標本中Hp分離培養速度的比較標本接種后，每24小時(shí)觀(guān)察一次，如出現可疑Hp菌落，則取菌涂片行革蘭染色鏡檢，并作脲酶、氧化酶、觸酶和PCR鑒定。如果形態(tài)染色典型，脲酶、氧化酶、觸酶及PCR陽(yáng)性則確認為標本Hp分離陽(yáng)性。用BHI-EA培養基培養24小時(shí)后陽(yáng)性例數在總陽(yáng)性例數中的比率為21%(12/57)，高于BHIA上24 h的陽(yáng)性比率2%(1/52)，兩者相差顯著(zhù)(P＜0.01)。培養48 h后BHI-EA上的陽(yáng)性比率為88%(50/57)，也顯著(zhù)高于BHIA上的陽(yáng)性比率60%(31/52)(見(jiàn)表1)，證明BHI-EA培養基能顯著(zhù)縮短胃標本中Hp的檢出時(shí)間。

   表1 兩種培養基上不同時(shí)間胃粘膜標本分離Hp的陽(yáng)性例數

    2.2 兩種培養基上胃標本Hp分離陽(yáng)性率比較分別對82例不同胃病患者(胃癌9例，胃炎16例，胃潰瘍23例，十二脂腸潰瘍24例，其它胃疾病10例)胃粘膜標本進(jìn)行分離培養。結果在BHIA上陽(yáng)性分離率為63%(52/82)，而在BHI-EA上陽(yáng)性率為70%(57/82)。培養結果表明，BHIA與BHI-EA對不同消化道疾病患者胃粘膜的Hp分離陽(yáng)性率基本一致，BHI-EA稍高于BHIA，無(wú)統計學(xué)差異(P＞0.05)。

    2.3 兩種培養基上Hp純培養生長(cháng)速度的比較所有Hp分離株在此兩種培養基上均能順利生長(cháng)，但生長(cháng)速度明顯不同，分別取前述57例陽(yáng)性標本的分離菌株進(jìn)行純培養。在BHI-EA上12 h即有4株菌長(cháng)出肉眼可見(jiàn)菌落，24 h內陽(yáng)性結果為41例，陽(yáng)性率為72%(41/57)。而BHIA上12 h內無(wú)明顯菌落出現，直到24 h才有8株菌株出現，陽(yáng)性率僅為14%(8/57)，顯著(zhù)低于BHI-EA組(P＜0.01)。

    3 討論

    最近幾年報道的針對Hp培養的無(wú)血培養基基本解決了應用含血培養基易污染的問(wèn)題。但其培養速度仍較慢，我們采用的改良無(wú)血培養基充分解決了這一問(wèn)題，在此培養基中，我們加入了相當于常規卵黃培養基中兩倍的卵黃量，同時(shí)加入適量的胰蛋白胨成份，充分滿(mǎn)足Hp生長(cháng)營(yíng)養需求，有效地刺激其生長(cháng)，此外加入可溶性淀粉可吸附標本中有毒物質(zhì)及Hp生長(cháng)的代謝產(chǎn)物，保證Hp處于有利的生長(cháng)環(huán)境。由實(shí)驗結果可以得出，改良卵黃培養基能大大提高Hp的生長(cháng)速度從而較大程度的節省培養時(shí)間，而且各項生物學(xué)性狀均很典型，完全能滿(mǎn)足臨床診斷及Hp的研究所需，是一種實(shí)用的Hp培養方法。

    幽門(mén)螺桿菌作為人胃內定居菌，對營(yíng)養成分、氣體條件等均有較嚴格的要求，使其在體外培養中受到很多因素的影響，因此培養基在制備過(guò)程中應嚴格控制pH值和各種成份的含量，特別是抗生素濃度及葡萄糖的含量。此外，由于Hp生長(cháng)需要一定濕度條件，故在培養基傾倒平板后，應密封放4°C冰箱待用，放置時(shí)間不宜超過(guò)兩周，保證Hp在新鮮培養基中有一最佳生長(cháng)環(huán)境。另外，由于此培養基能有效的促進(jìn)Hp生長(cháng)，故在培養過(guò)程中應掌握好時(shí)間以防生長(cháng)過(guò)度導致細菌球性變。

    參考文獻

    1 Sahay P,West A P,Hawkey P M,et al.Isolation of Helicobacter pylori from faeces.J Infect,1995,30:262～263

    2 Ferguson D A J,Li C,Patel N R,et al.Isolation of Helicobacter pylori from saliva.J Clin Microbiol,1993,31:2802～2804

    3 Hirata I,Itoh T,Masubuchi N，et al.Isoaltion identification and quantitative culture of Helicobacter pylori from gastric mucosa.Nippon Rinsho,1993,51:3170～3175

    4 牟兆欽，尹秀云，李富裕，等.用無(wú)血腦心浸液卵黃瓊脂培養基分離培養幽門(mén)螺桿菌的研究.軍事醫學(xué)科學(xué)院院刊，1995,19(1):63

    5 吳開(kāi)宇，吳平，潘秀珍，等.一種用于幽門(mén)螺桿菌培養和菌種保存的培養基――卵黃培養基.微生物學(xué)通報，1992，19(2):112

    6 周殿元，等主編.幽門(mén)螺桿菌感染的基礎與臨床.北京：中國科技出版社，1997.290

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