瓊脂擴散法檢測卵黃抗體效價(jià)影響因素的分析

1.1.2抗原性質(zhì)：抗原的種類(lèi)、抗原決定簇的數目和理化性質(zhì)等因素都能影響瓊脂擴散試驗的結果。瓊脂擴散試驗是利用可溶性的抗原與抗體在瓊脂凝膠網(wǎng)格中的水中自有擴散，相互結合形成的沉淀線(xiàn)來(lái)判斷結果的。這樣就要求抗原與抗體必須都是可溶性的，因為一些顆粒性的抗原如細菌、紅細胞等是不溶的，這樣的抗原相對應的卵黃抗體效價(jià)就不能用瓊脂擴散試驗來(lái)測定。在瓊脂擴散試驗中要求抗原是多價(jià)的（抗原決定簇≥2），單價(jià)抗原不能形成抗原抗體復合物，因此不能產(chǎn)生可見(jiàn)反應�？乖�的分子量、PH值等理化因素也直接影響到實(shí)驗的結果。
1.2抗原抗體的反應特征  抗原抗體反應特征影響瓊脂擴散試驗結果的因素有:抗原抗體最適比、抗原抗體反應的可逆性、抗原抗體的量。

1.2.1抗原抗體的最適比[3]：抗原抗體的反應雖決定于兩者的化學(xué)構型的相應性，但不同于一般的化學(xué)反應，其結合比例不完全符合化學(xué)反應的質(zhì)量作用定律，因為抗原抗體的結合是一種多價(jià)相互作用的結合�？乖�根據分子大小的不同，結合位點(diǎn)變化很大，由10－50不等，有的甚至達到200個(gè)；卵黃中的抗體成份主要是IgG，有兩個(gè)結合位點(diǎn)，卵黃抗體除了常見(jiàn)的雞傳染性法氏囊炎抗體外，還有鴨病毒性肝炎、豬瘟[4]等高免卵黃抗體，這些抗體的效價(jià)都可以用瓊脂擴散試驗來(lái)測定。當抗原抗體的濃度比例適宜時(shí)，抗原抗體結合后尚未達到飽和的位點(diǎn)可與其它游離的抗原抗體繼續結合，逐漸形成越來(lái)越大的復合物。最后在抗原與抗體孔之間形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線(xiàn)。此時(shí)反應最快、最明顯。但當兩者的量不適合時(shí)，少的一方在聚合初期就達到飽和，沉淀線(xiàn)變得不清晰甚至沒(méi)有沉淀線(xiàn)，而且沉淀線(xiàn)偏移，向量少的一方移動(dòng)。
1.2.2抗原抗體反應的可逆性[3]：抗原抗體之間的結合是依靠分子間的近距離力：氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力。兩者的距離越近，結合的位點(diǎn)越多，形成的近距離力也越大，結合的也越牢固。這些作用力在生理狀態(tài)下最大。由于抗原抗體反應是分子表面的非分子結合，所形成的復合物并不牢固，可以隨時(shí)解離，解離的抗原抗體保持原來(lái)的生物活性，可與其它的抗原抗體再一次結合，在整個(gè)反應體系中形成動(dòng)態(tài)平衡，平衡式為：Ag+Ab≒AgAb。這種平衡易受到溫度、PH等物理的、化學(xué)的因素的影響而改變。當溫度大于60℃，PH值降到3以下時(shí)，由于同離子效應等因素，使抗原抗體蛋白質(zhì)的近距離力遭到破壞，結構發(fā)生改變，導致抗原抗體復合物重新解離。

1.2.3抗原抗體的總量：瓊脂擴散試驗中所形成的沉淀線(xiàn)的粗細、清晰度與抗原抗體的量成正比例關(guān)系。因為我們這篇文章主要是討論影響卵黃抗體效價(jià)測定的因素，所以主要考慮影響抗原的外界因素�？乖�反復凍溶以及長(cháng)期把它放在室溫下都能使大量的抗原破裂失去活性。所以在保存與運輸抗原時(shí)應放在冷凍條件下進(jìn)行。
1.3抗原抗體的純度：抗原與其對應的抗體的反應屬于特異性反應。但是如果兩者含有過(guò)多與反應無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)、類(lèi)脂質(zhì)、多糖等非特異性物質(zhì)，往往抑制抗原抗體的特異性反應，而出現一些非特異性反應。

2瓊脂因素
瓊脂擴散試驗的結果在很大程度上也受到瓊脂的成份、瓊脂板厚度、瓊脂的濃度、實(shí)驗用水質(zhì)量、PH值、電解質(zhì)濃度、抗原抗體孔間距離及瓊脂水分的影響。
2.1瓊脂的成份：影響瓊脂擴散試驗結果的瓊脂成份因素主要是不溶性雜質(zhì)。一些大的不溶性雜質(zhì)能直接堵塞瓊脂的網(wǎng)格，這樣的雜質(zhì)過(guò)多會(huì )影響抗原抗體的擴散，為了避免這些雜質(zhì)的影響，應在瓊脂粉融化后用脫脂棉或紗布過(guò)濾，或者選擇高質(zhì)量的瓊脂粉加工瓊擴板。
2.2瓊脂板的厚度：瓊脂板的厚度應為3mm左右，因為由于重力作用，加入孔中的抗原抗體會(huì )發(fā)生沉淀，導致上下層的濃度形成差，濃度大的向瓊脂網(wǎng)格中擴散的速度要比濃度小的快，同時(shí)又由于抗原抗體的質(zhì)量與體積的差異，所以?xún)烧咝纬傻臐舛炔钍遣煌�的，擴散速度的差異也不同，如果瓊脂板很厚，同一孔上下層擴散速度差異及抗原抗體之間擴散速度的差異都很大，致使抗原抗體孔之間形成的沉淀線(xiàn)上下層之間就不在同一平面上，影響瓊脂擴散試驗的結果的觀(guān)察；相反如果瓊脂板太薄，所加的抗原抗體量很小，沉淀線(xiàn)不清晰甚至不出現沉淀線(xiàn)。

2.3瓊脂的濃度：瓊脂凝膠網(wǎng)格允許通過(guò)物質(zhì)的最大分子量與瓊脂濃度成反比（見(jiàn)表1），卵黃抗體IgG的分子量為1.8×105[5],1％－1.5％的瓊脂溶液網(wǎng)格能允許絕大多數大分子抗原自由擴散，大于這個(gè)濃度范圍的瓊脂網(wǎng)格太小不利于大分子抗原如雞馬立克氏病病毒（分子量為1.03×10⁸）、雞傳染性喉氣管炎病毒[6]的擴散，濃度太小瓊脂骨架太少不利于抗原抗體復合物的沉淀，從而影響瓊脂擴散試驗的結果。
表1瓊脂糖凝膠Bio-Gel A型的數據[7]
型號  Bio-Gei A瓊脂糖含量%分級范圍（球蛋白）
A-0.5m101×10⁴～5×10⁵
A-1.5m81×10⁴～1.5×10⁶
A-5m61×10⁴～5×10⁶
A-15m44×10⁴～1.5×10⁷
A-50m21×10⁵～5×10⁷
A-150m11×10⁶～1.5×10⁸
2.4實(shí)驗用水的質(zhì)量：瓊脂擴散試驗的結果在很大程度上也受到實(shí)驗用水的影響。如果實(shí)驗用水中含大量重金屬離子如鉛、汞、銅等，會(huì )使蛋白質(zhì)成份的抗原抗體變性失去活性，不能再發(fā)生特異性反應，影響瓊脂擴散試驗的結果。

2.5 PH值：抗原抗體大部分是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在一定的PH處所帶的凈電荷數為零，此時(shí)的PH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，大部分蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在PH5-5.5之間，在等電點(diǎn)處，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力減少，趨于凝集狀態(tài)而發(fā)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處的溶解度最低。當瓊脂的PH在抗原抗體等電點(diǎn)處時(shí)，抗原抗體會(huì )發(fā)生非特異性的沉淀，影響瓊脂擴散試驗的實(shí)驗結果。一般瓊脂擴散試驗的PH為6－8（比等電點(diǎn)稍高）[2]。當PH小于3時(shí)，往往使抗原抗體結合物變性或再次解離，如IgG在PH4.0－11.0穩定，馬立克氏病毒在PH3或PH11處理10分鐘失活[6]。見(jiàn)本文1.1.2。
2.6電解質(zhì)的濃度：電解質(zhì)的濃度對瓊脂擴散試驗的結果影響也很大�？乖�抗體具有膠體性質(zhì)，含有氨基、羧基、肽鏈等極性基團，與水相互結合，形成水化層，因為蛋白質(zhì)帶有相同的電荷，所以膠體所帶電荷相同，互相排斥，在水中穩定存在，抗原抗體帶有相反的極性，等兩者結合后，表面的電荷減少或消失，水化層也減弱，由親水型變?yōu)槭杷�型，此時(shí)如有適當濃度的電解質(zhì)，能進(jìn)一步降低抗原抗體表面的電荷，促進(jìn)他們沉淀，最常用的電解質(zhì)為氯化鈉，哺乳動(dòng)物血清學(xué)反應濃度為0.15mol，即生理鹽水，禽類(lèi)8％[8]。但過(guò)高濃度的電解質(zhì)反而不利于抗原抗體沉淀物的形成，有兩個(gè)原因：○1過(guò)高濃度的電解質(zhì)阻止蛋白質(zhì)與水分子的相互作用，破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，產(chǎn)生鹽析效應，使抗原抗體發(fā)生非特異性的沉淀。過(guò)高濃度的電解質(zhì)濃度（大于或等于15％）可使抗原抗體結合物離解。見(jiàn)本文1.1.2。
2.7孔間距離：抗原抗體的孔間距離也能影響瓊脂擴散試驗的結果。當兩者之間的孔距為3mm時(shí)，抗原抗體既能形成合適的濃度梯度又能充分結合。當兩者的孔間距離過(guò)大時(shí)，雖然能形成合適的濃度梯度，但由于抗原抗體量太少卻不能充分結合，相反孔距太小，雖然結合的量很大卻不能形成合適的濃度梯度，都能影響瓊脂擴散試驗的結果。
2.8瓊脂水分：瓊脂凝膠網(wǎng)格內含有大量水分，如果瓊脂板儲存時(shí)間太長(cháng)或儲存環(huán)境太干燥又沒(méi)有放在密閉環(huán)境中，水分就會(huì )大量的揮發(fā)，直接影響抗原抗體擴散的效果。
3抗原抗體反應條件
  一些培養條件如反應溫度、反應濕度、反應時(shí)間也是影響瓊脂擴散試驗結果的重要因素。‘
3.1反應溫度  影響瓊脂擴散試驗結果的溫度因素包括:反應溫度的高低與反應溫度波動(dòng)情況。z
3.1.1反應溫度的高低：抗原抗體的反應速度、結合程度與反應溫度高低有密切關(guān)系。溫度高，分子運動(dòng)加快，增加抗原抗體碰撞幾率，反應會(huì )加快，但當溫度超過(guò)56℃時(shí)反應速度反而變慢，溫度再高，抗原抗體復合物往往會(huì )重新解離，甚至會(huì )被破壞。例如卵黃抗體在≥65℃情況下性質(zhì)就會(huì )變得不穩定，雞馬立克氏病毒從感染雞皮膚中制備的脫離細胞制劑在56℃處理30分鐘或在60℃處理10分鐘都能失活，傳染性法氏囊炎病毒在70℃處理30分鐘失活[6]。反應溫度低時(shí)，反應速度變慢，但抗原抗體結合完全，沉淀量增多，結果清晰。但溫度過(guò)低，反應無(wú)法進(jìn)行，也不會(huì )出現結果。最適的反應溫度為37℃[8]。
3.1.2反應溫度的波動(dòng)情況:瓊脂擴散試驗的培養溫度應恒定，如果波動(dòng)太大，會(huì )使抗原抗體在擴散時(shí)形成不連續的濃度梯度，影響兩者產(chǎn)生最適比，最終影響到實(shí)驗結果。
3.2空氣濕度：瓊脂擴散試驗是抗原抗體在瓊脂網(wǎng)格中的水中擴散時(shí)形成的結果，如果空氣中濕度太低，瓊脂中的水分很容易蒸發(fā)，使瓊脂網(wǎng)格中的水分減少，不利于抗原抗體的自由擴散，同時(shí)加到瓊脂孔中的抗原抗體的水分也很容易蒸發(fā)，使卵黃中的抗體及抗體被固定在孔中不容易向瓊脂凝膠中擴散。所以在培養時(shí)，往往倒置平皿，然后放在一個(gè)有濕棉紗布的有蓋搪瓷盤(pán)中，以防水分蒸發(fā)。
3.3反應時(shí)間：抗原抗體在瓊脂中的擴散需要一定時(shí)間。如果反應時(shí)間太短，使抗原抗體沒(méi)有完全擴散以致結合的不充分或結合后還沒(méi)有達到沉淀的程度，導致本應形成的沉淀線(xiàn)沒(méi)有出現；時(shí)間太長(cháng)，在室溫條件小，大量抗原抗體會(huì )失去生物活性，已經(jīng)形成的沉淀帶發(fā)生解離消失而出現假像。
4其他因素
 抗原抗體加的多少、打孔后瓊脂底部融封效果都能影響瓊脂擴散試驗的結果，本文1.3所述。當抗原抗體的量加的多時(shí)，所產(chǎn)生的沉淀線(xiàn)粗，為了減小各個(gè)實(shí)驗的相對誤差，加樣時(shí)，都應加到滿(mǎn)而不溢程度。此外，打孔后瓊脂板底部松動(dòng)，如果不加熱封好，在實(shí)驗過(guò)程中，抗原抗體就不通過(guò)瓊脂網(wǎng)格擴散，而是直接在底部流出，不會(huì )產(chǎn)生沉淀線(xiàn)。
 總之，瓊脂擴散試驗能有效的指導養殖戶(hù)、獸醫工作者制定合理的免疫程序，但是由于受到以上諸多因素的影響，因此，為了得出真實(shí)的實(shí)驗結果，操作者應本著(zhù)科學(xué)、嚴謹的態(tài)度進(jìn)行操作，以克服不良因素的影響.

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