微生物常規鑒定技術(shù)——生理生化試驗

　微生物生化反應是指用化學(xué)反應來(lái)測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類(lèi)鑒定中的重要依據之一。

　　微生物檢驗中常用的生化反應有：

１、糖酵解試驗

　　不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣�？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。

　　試驗方法：以無(wú)菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養物少許，接種于發(fā)酵液體培養基管，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養，每天觀(guān)察結果，檢視培養基顏色有無(wú)改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無(wú)氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線(xiàn)和管壁及管底有無(wú)微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養物可呈彌散生長(cháng)。

　　本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍和An-drade指示劑。

２、淀粉水解試驗

　　某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。

　　試驗方法：以18~24h的純培養物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區接種，試驗數種培養物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養24~48h，或于20°培養5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養表面，若為液體培養物，則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果，陽(yáng)性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周?chē)�出現無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍色。

　　淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗結果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養時(shí)間，培養基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。

３、V-P試驗

　　某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱(chēng)V－P（+）反應。

　　試驗方法：

　�。保㎡^’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養基，于36±1°C培養48h，培養液1ml加O^’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內不呈現伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結果者。

　�。玻〣arritt氏法：將試驗菌接種于通用培養基，于36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2~5min，陽(yáng)性菌常立即呈現紅色，若無(wú)紅色出現，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

　�。常┛焖俜ǎ簩�0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結果。不產(chǎn)酸的培養物不能使用。

　　本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時(shí)，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應省去或以氯化鈉代替。

４、甲基紅（Methyl Red）試驗

　　腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

　　試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種于通用培養基，培養于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽(yáng)性呈鮮紅色，弱陽(yáng)性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。

　　甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應延長(cháng)培養時(shí)間，重復試驗。

５、靛基質(zhì)（Imdole）試驗

　　某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來(lái)。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

　　試驗方法：將待試純培養物小量接種于試驗培養基管，于36±1C培養24h時(shí)后，取約2ml培養液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽(yáng)性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸面呈紅色，即為陽(yáng)性。

　　實(shí)驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現紅色，因而結果更為可靠。

６、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗

　　有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

　　試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養物或瓊脂斜面培養物表面，立即或于10min內呈現紅色即為試驗陽(yáng)性，若無(wú)紅色出現則為陰性。

　　用α-萘胺進(jìn)行試驗時(shí)，陽(yáng)性紅色消退很快、故加入后應立即判定結果。進(jìn)行試驗時(shí)必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應加注意。

７、明膠（Gelatin）液化試驗

　　有些細菌具有明膠酶（亦稱(chēng)類(lèi)蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

　　試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養基。于20~22℃培養7~14天。明膠高層亦可培養于36±1℃。每天觀(guān)察結果，若因培養溫度高而使明膠本身液化時(shí)應不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀(guān)察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽(yáng)性。平板試驗結果的觀(guān)察為在培養基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽(yáng)性，10~20min后，菌落周?chē)鷳�出現清晰帶環(huán)。否則為陰性。

８、尿素酶（Urease）試驗

　　有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。

　　試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物大量接種于液體培養基管中，搖均，于36±1℃培養10，60和120min，分別觀(guān)察結果�；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養2，4和24h分別觀(guān)察結果，如陰性應繼續培養至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。

９、氧化酶（Oxidase）試驗

　　氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應。

　　試驗方法：在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽(yáng)性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍色。陰性者無(wú)顏色改變。應在數分鐘內判定試驗結果。

10、硫化氫（H₂S）試驗

　　有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

　　試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養24~28h，培養基呈黑色為陽(yáng)性。陰性應繼續培養至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養基上空，以不會(huì )被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養1~6天。紙條變黑為陽(yáng)性。

11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗

　　試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養18~24h，觀(guān)察結果。

　　本試驗可同時(shí)觀(guān)察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，所以仍保持黃色。

12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗

　　試驗方法：以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養18~24h，觀(guān)察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽(yáng)性，混濁或沿穿刺線(xiàn)向外生長(cháng)為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性。培養基未接種的下部，可作為對照。

　　本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著(zhù)提高篩選功效。