稀釋培養測數法（MPN）

一、實(shí)驗目的

通過(guò)對好氣性自生固氮菌的計數，了解稀釋培養計數（MPN）的原理和方法。

二、實(shí)驗原理  

    最大或然數(most probable number，MPN)計數又稱(chēng)稀釋培養計數，適用于測定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類(lèi)群。其特點(diǎn)是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來(lái)擺脫其他微生物類(lèi)群的干擾，并通過(guò)該生理功能的表現來(lái)判斷該類(lèi)群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細菌等。見(jiàn)附表23-1）的數量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類(lèi)群（如大腸菌群）的數量，缺點(diǎn)是只適于進(jìn)行特殊生理類(lèi)群的測定，結果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計數時(shí)才采用。 

MPN計數是將待測樣品作一系列稀釋?zhuān)�一直稀釋到將少量（�?SPAN lang=EN-US>lm1）的稀釋液接種到新鮮培養基中沒(méi)有或極少出現生長(cháng)繁殖。根據沒(méi)有生長(cháng)的最低稀釋度與出現生長(cháng)的最高稀釋度，采用“最大或然數”理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數的近似值。具體地說(shuō)，菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，一定量菌液中細菌可以極少或無(wú)菌，然后每個(gè)稀釋度取3—5次重復接種于適宜的液體培養基中。培養后，將有菌液生長(cháng)的最后3個(gè)稀釋度（即臨界級數）中出現細菌生長(cháng)的管數作為數量指標，由最大或然數表（見(jiàn)附錄九）上查出近似值，再乘以數量指標第一位數的稀釋倍數，即為原菌液中的含菌數。

如某一細菌在稀釋法中的生長(cháng)情況如下；

    稀釋度          lO^-3    10^-4    10^-5    lO^-6    10^-7   10^-8

    重復數           5      5      5      5      5     5

    出現生長(cháng)的管數   5      5      5      4      1     0

    根據以上結果，在接種lO^-3—10^-5稀釋液的試管中5個(gè)重復都有生長(cháng)，在接種lO^-6稀釋液的試管中有4個(gè)重復生長(cháng)，在接種10^-7稀釋液的試管中只有1個(gè)生長(cháng)，而接種10^-8稀釋液的試管全無(wú)生長(cháng)。由此可得出其數量指標為“541”，查最大或然數表得近似值17，然后乘以第一位數的稀釋倍數（10^-5的稀釋倍數為100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌數＝17×100 000 = 17×10⁵。即每毫升原菌液含活菌數為l700000個(gè)。

在確定數量指標時(shí)，不管重復次數如何，都是3位數字，第一位數字必須是所有試管都生長(cháng)微生物的某一稀釋度的培養試管，后兩位數字依次為以下兩個(gè)稀釋度的生長(cháng)管數，如果再往下的稀釋仍有生長(cháng)管數，則可將此數加到前面相鄰的第三位數上即可。

如某一微生物生理群稀釋培養記錄為：

    稀釋度           lO^-1      10^-2     10^-3     lO^-4     10^-5     10^-6

    重復數            4       4       4      4       4       4

    出現生長(cháng)的管數    4       4       3      2       1       0

    以上情況，可將最后一個(gè)數字加到前一個(gè)數字上，即數量指標為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×10²個(gè)。按照重復次數的不同，最大或然數表又分為三管最大或然數表、四管最大或然數表和五管最大或然數表。

    應用MPN計數，應注意兩點(diǎn)，一是菌液稀釋度的選擇要合適，其原則是最低稀釋度的所有重復都應有菌生長(cháng)，而最高稀釋度的所有重復無(wú)菌生長(cháng)。對土壤樣品而言，分析每個(gè)生理群的微生物需5—7個(gè)連續稀釋液分別接種，微生物類(lèi)群不同，其起始稀釋度不同(見(jiàn)附表1)；二是每個(gè)接種稀釋度必須有重復，重復次數可根據需要和條件而定，一般2—5個(gè)重復，個(gè)別也有采用2個(gè)重復的，但重復次數越多，誤差就會(huì )越小，相對地說(shuō)結果就會(huì )越正確。不同的重復次數應按其相應的最大或然數表計算結果。

若要求出土樣中每克干土所含的活菌數，則要將前述兩例中所得的每毫升菌數除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分數（烘干后的土樣質(zhì)量／原始土樣的質(zhì)量）。 

三、實(shí)驗器材                    

1. 土壤樣品：肥沃菜園土

2. 培養基：阿須貝（Ashby）無(wú)氮培養液(附錄三、15)22管(每管裝5ml，加1cm×4.5cm濾紙l條)

3. 器材：90ml無(wú)菌水（裝入250 ml三角瓶中，并裝有15—20個(gè)玻璃珠）、9ml無(wú)菌水、lml刻度無(wú)菌吸管、試管架、記號筆。

四、實(shí)驗方法

    1．稱(chēng)取10克土樣，放入90ml無(wú)菌水中，振蕩20min，讓菌充分分散，然后按十倍稀釋法將供試土樣制成10^-1—10^-6的土壤稀釋液。

2．將22支裝有Ashby無(wú)氮培養液的試管按縱4橫5的方陣排列于試管架上，第一縱列的4支試管上標以10^-2，第二縱列的4支試管上標以10^-3……第五縱列的4支管上際以10^-6（即采用5個(gè)稀釋度，4個(gè)重復），另外2支試管留作對照。

3．用lml無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取10^-6的土壤稀釋液各lml放入編號10^-6的4支試管中，再吸取10^-5稀釋液各lml放入編號10^-5的4支試管中，同法吸取10^-4、10^-3、10^-2稀釋液各lml放入各自對應編號的試管中。對照管不加稀釋液。

4．將所有試管置28—30℃培養7天后觀(guān)察結果。

5．精確稱(chēng)取3份10克稀釋用土，放入稱(chēng)量瓶中，置105-110℃烘2h后放入干燥器中，至恒重后稱(chēng)重，然后計算干土在土樣中所占的質(zhì)量份數。

五、實(shí)驗作業(yè)：

    培養7天后，取出試管，檢查實(shí)驗結果。

    凡有固氮菌生長(cháng)的試管，則培養液與濾紙接觸處有黑褐色或粘液狀菌膜，即為陽(yáng)性，否則為陰性。對照管應為陰性。依次檢查每管生長(cháng)情況，將結果填入下表，計算每克干土所含的活菌數。

附表23-1 幾種主要微生物生理群MPN計數法一覽表

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