培養基凝固劑及觸變性培養基

摘要 介紹常用培養基凝固劑瓊脂、 卡拉膠和黃原膠的凝膠性質(zhì)。將這三種凝膠配伍使用可配制出具有觸變性的培養基 ，用于特殊的微生物檢測。 

關(guān)鍵詞 培養基 凝固劑 觸變性 

微生物培養基是專(zhuān)供微生物培養、分離、鑒別、研究和保藏用的混合營(yíng)養物制品，常見(jiàn)形態(tài)

有液態(tài)、流態(tài)、半固態(tài)和固態(tài)。液體培養基常用于大規模生產(chǎn)和增菌培養；流體培養基常用于霉菌和厭氧菌的檢查；半固體培養基常用于菌種傳代和保藏，以及貯運標本；固體培養基常用于微生物的分離純化，抗菌藥物的效價(jià)試驗，菌和疫苗的制造以及菌種保藏。這幾種培養基的差別主要取決于培養基中凝固劑種類(lèi)和加量的差^［1］。培養基凝固劑一般并不是微生物的營(yíng)養成分，只起固化或粘合的作用^［2］，形成凝膠。常見(jiàn)的凝固劑有瓊脂、卡拉膠、黃原膠、阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠和無(wú)機硅膠等。

凝膠是膠體質(zhì)點(diǎn)或高聚物分子相互交聯(lián)形成的空間網(wǎng)狀結構，是介于固體與液體之間的一種特殊的物質(zhì)形態(tài)^［3］。凝膠化是指縮聚反應進(jìn)行到一定程度，反應體系的粘度突然增大，并且出現具有彈性的凝膠的現象。此時(shí)，體系包含兩部分：一部分是凝膠 ，不溶于一切溶劑 ；另一部分是溶膠，其分子量較小，被籠罩在凝膠的網(wǎng)絡(luò )結構中^［4］。

由于微生物快速檢測的需要，傳統的固體及液體培養基已經(jīng)不能滿(mǎn)足現代微生物檢測的需求。如檢測油類(lèi)物質(zhì)中的微生物，培養基在接種時(shí)應為粘度低的溶膠，而在靜止培養時(shí)，又需恢復為高粘凝膠，使菌落不易移動(dòng)，便于觀(guān)察與計數，這就需要培養基具有觸變性。國外已商品化生產(chǎn)的有 MicrobMonitor^［2］培養基成品。使用前不需進(jìn)行培養基的制備和加熱就可直接應用，但國內還沒(méi)有類(lèi)似產(chǎn)品。

1 瓊脂

瓊脂是一種由瓊脂糖和瓊膠質(zhì)組成的長(cháng)鏈多糖復合體，是從石花菜、江籬、紫菜等紅藻類(lèi)植物中提取而制成的。 

在液體培養基中加l0～ 20 g／L的瓊脂 ，加熱融化凝固后可得固體培養基，加5 g／ L的瓊脂可得半固體培養基^［2］ 。

瓊脂溶于 7 5 ℃以上的熱水和甲酰胺，微溶于乙醇胺，不溶于冷水，但能吸水膨脹。瓊脂溶解后，膠液具有一定的粘性，5％ ～10％的瓊脂溶膠具有高粘度。在45℃、p H   4．5～9．0時(shí)，膠液的粘度相對穩定，在 pH 6．0～8．0范圍內，膠液粘度與藻齡、離子強度關(guān)系不大，但一旦凝膠形成，在溫度不變的條件下，粘度隨時(shí)間而增大。瓊脂溶解后，膠液在42 ℃以下會(huì )凝固。文獻^［5］報道由不同種類(lèi)的原料所制取的瓊脂具有不同的凝固溫度，而由相同原料制取的瓊脂，其凝固溫度基本一致。瓊脂的凝膠強度與其濃度和生

產(chǎn)方法有關(guān)，韌性與其粘度和原料的種類(lèi)有關(guān)瓊脂的融化溫度與凝固溫度之差即滯后度比一般凝膠大，為40—60℃。pH接近中性時(shí)，瓊脂能與大部分多糖膠配伍，與蛋白質(zhì)混合不發(fā)生絮凝，也不明顯沉淀 ( 組胺樹(shù)膠除外) 。

瓊脂的流變性變化是瓊脂凝膠化過(guò)程的一個(gè)重要特征：①高溫時(shí)，流變行為與稀溶液中聚合

物的流變行為相似；②當溫度低至凝固點(diǎn)以下時(shí)，流變行為與交聯(lián)聚合物的流變行為相似；③在溶膠與凝膠的變化過(guò)程中，流變性更為復雜；④瓊脂的流變性還受其濃度、分子量以及其它物質(zhì)(如甘油等)的影響。    

2 卡拉膠

卡拉膠是存在于杉�？嗫�、蘇里爾藻科、葉頂藻科和沙藻科的某些紅海藻中的不溶性膠。它溶于60℃以上的熱水，形成粘性透明或輕微乳白色的易流動(dòng)溶液，45℃以下凝固^［7］，2．0 ％ 一 2．5 ％的凝膠強度與瓊脂1．5 ％ 一2．0 ％濃度時(shí)的凝膠強度基本一致^［8］，但不溶于有機溶劑�？ɡ�膠大分子沒(méi)有分支結構，也不具有陰離子特性， 可以形成高粘度溶液。

( 1 )徐志麗和吳暉^［9］ 研究發(fā)現卡拉膠的粘度：①隨分子量的增大而顯著(zhù)增大；②隨濃度增大呈指數規律增加；③隨溫度升高呈指數規律下降；④在接近中性時(shí)基本穩定且最大。

( 2 )卡拉膠溶液的粘度：①隨恒溫時(shí)間而降低；②100℃時(shí)，下降有急有緩；③隨著(zhù)轉速增大，溶液粘度緩慢下降，具有剪切稀化的特征；④隨攪拌時(shí)間先緩慢上升，80min后又下降^［10］

( 3 )卡拉膠的凝膠強度：①在一定范圍內與濃度呈正線(xiàn)性關(guān)系；②溫度上升，凝膠強度下降，但溫度升降過(guò)程的變化曲線(xiàn)不同；③在凝膠開(kāi)始形成的短時(shí)間內，凝膠強度隨時(shí)間迅速增大，然后相對穩定，十余小時(shí)后又開(kāi)始下降；④p H< 5．0時(shí)，凝膠強度隨p H的增大而增強，p H 5．0—8．5時(shí)趨于平衡，pH8．0—9．5時(shí)又下降， 而當p H> 9．5時(shí)又回升。

( 4 )卡拉膠形成凝膠所需濃度低，透明度高，但存在凝膠脆性大、彈性小、易脫液收縮等問(wèn)題。這些問(wèn)題可通過(guò)與其它高聚物配伍的方法來(lái)解決，國內外學(xué)者對此做了大量研究。黃來(lái)發(fā)等^［11］研究發(fā)現槐豆膠和卡拉膠的相互作用使凝膠較強韌、較柔軟，且不易出現脫液收縮的現象。

3 黃原膠

黃原膠是由植物的細菌性病害甘藍黑腐病產(chǎn)生，由β—D一葡萄糖、β—D一甘露糖和 β—D一葡萄糖醛酸三種單糖組成的。它遇水分散、乳化變成穩定的親水性粘稠膠體，膠液呈中性。黃原膠溶液是典型的假塑性流體，添加海藻酸鈉可改善其假塑性程度^［12］。  

Pettitt^［13］的綜述是黃原膠應用的理論基礎。 

( 1 )黃原膠溶液的粘度與溫度和濃度有關(guān)：①室溫下低濃度黃原膠溶液的粘度就很高；②室溫下質(zhì)量分數為0．5％溶液的粘度約為0．4Pa·s ；③質(zhì)量分數為1％溶液的粘度約為1Pa·s ；④質(zhì)量分數為2％溶液的粘度約為 3—4 Pa·s ；⑤在90℃以下，溫度變化對黃原膠溶液的粘度影響很��；⑥在90℃以上，溶液中的螺旋網(wǎng)格結構被破壞，但這個(gè)過(guò)程是熱可逆的。

( 2 )粘度變化與溶液 p H值和其他添加劑的存在也有關(guān)：①p H值較高時(shí)，二價(jià)金屬離子會(huì )引起黃原膠膠凝；②多價(jià)鹽類(lèi)也會(huì )引起膠凝，高pH值時(shí)尤為明顯；③三價(jià)金屬離子在中性，甚至酸性條件下都會(huì )引起黃原膠膠凝；④添加鰲合劑可防止膠凝作用。

( 3 )黃原膠對多種植物膠具有特異性的凝集反應，凝集反應研究是從半乳甘露聚糖中的洋槐豆膠和瓜爾膠開(kāi)始的^［14］，進(jìn)一步研究發(fā)現：①黃原膠與糊精、瓜兒豆膠和刺槐豆膠混合時(shí)表現出粘度增加的協(xié)同效應；②黃原膠還可以與大多數合成的水溶性聚合物 ( 除高濃度的丙烯酸聚合物外)配伍；③阿拉伯膠在中至高濃度范圍內可與黃原膠生成絡(luò )合物；④建議黃原膠不要與纖維素衍生物配伍。

4 觸變性培養基的制備

觸變性流體的流變行為與觀(guān)測時(shí)間有關(guān)：①維持恒定的剪切速率所需的剪切應力隨時(shí)間而減小^［15］，因為在外剪切力的作用下，體系的粘度隨時(shí)間下降；②當剪切作用停止后，粘度隨時(shí)間的推移而增高，大多數經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，可以恢復到初始粘度值；③觸變性流體流動(dòng)曲線(xiàn)的上行曲線(xiàn)與下行曲線(xiàn)不重疊，兩條曲線(xiàn)之間形成了一個(gè)封閉的梭型觸變環(huán)。

前面已介紹了一些常見(jiàn)凝固劑的凝膠性質(zhì)和流變性質(zhì)。瓊脂、卡拉膠和黃原膠都可形成高粘度溶膠：①瓊脂形成凝膠后透明度高、彈性好、保水性好、無(wú)毒且不被微生物液化，但成本較高；②卡拉膠具有假塑性，透明度優(yōu)于瓊脂，原料來(lái)源廣泛、成本低，但彈性不及瓊脂好，較脆，凝固點(diǎn)高，滯后度��；③黃原膠也具有假塑性，對于熱解和化學(xué)、物理、生物的降解均具有強對抗作用，但其溶液是非觸變性的流體。所以，使用單一的凝固劑并不能得到較理想的觸變性培養基，需要將多種凝膠配伍使用。

將卡拉膠、黃原膠和瓊脂這三種凝膠聯(lián)合使用作為培養基支持物，試驗表明：

( 1 )當三種凝膠濃度分別為卡拉膠l3g／L 、黃原膠2g／L和瓊脂2．5g／L時(shí)，制取的培養基在振蕩時(shí)呈流動(dòng)性較好的溶膠狀，保持靜止5～30 s 后又可重新稠化，符合觸變性的特性。且培養基具有以下性質(zhì)：①澄清，透明度較高，顏色較淺，有利于觀(guān)察；②水相物質(zhì)可溶解，油相物質(zhì)乳化并溶解；③在恒溫箱中培養，可長(cháng)出離散的菌落；④泌水性不明顯；⑤不易被微生物降解；⑥能承受高溫滅菌。培養基的這些性質(zhì)使其特別適用于檢測油類(lèi)物質(zhì)中的微生物。

( 2 )在適當范圍內等比例增大或減小三種凝膠的濃度可改變膠液的流動(dòng)性。增大黃原膠的相對濃度，膠液的粘度也會(huì )相應增大。當黃原膠 濃度達到4g／L時(shí)，膠液的流動(dòng)性就變得很差。

( 3 )在配制過(guò)程中，應注意使這三種凝膠充分溶解。若未完全溶解，則配成的培養基會(huì )有顆粒懸浮物。為使凝膠溶解效果較好，可采取以下措施：①所用的凝膠應顆粒細小而均勻，若因放置時(shí)間過(guò)久而結塊，可用研缽磨細后再使用；②可先將凝膠稱(chēng)量好后用冷水浸泡數小時(shí)，再加熱溶解；③溶解三種凝膠時(shí)，最好加熱使膠液沸騰，確保凝膠完全溶解

( 4 )瓊脂可使培養基成胨狀，為了不讓培養基在滅菌后的冷卻過(guò)程中結成一整塊，在冷卻的同時(shí)用磁攪拌子加以攪拌，則能形成較細膩的假塑性流體。攪拌時(shí)，應受力均勻，否則培養基不均勻。

( 5 )注意在冷卻攪拌過(guò)程中保證無(wú)菌環(huán)境，以免染菌。

5   結語(yǔ)

隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信不久的將來(lái)，人們對微生物培養基凝固劑的各種性質(zhì)以及配伍作用的機理的認識將會(huì )越來(lái)越透徹，從而使現有的培養基功能更加完善，并配制出更多具有特殊功能的培養基，使培養基凝固劑得到更好應用。      

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