不同培養基對腸毒素大腸桿菌疫苗株產(chǎn)生菌毛的影響

【 摘要 】  目的通過(guò)比較不同培養基對疫苗株產(chǎn)生菌毛的影響，獲得一種有利于細菌生長(cháng)和菌毛產(chǎn)生，而且費用低廉的培養基。方法 通過(guò)測定培養物的密度，觀(guān)察疫苗菌株的生長(cháng)規律，用斑點(diǎn)ELIS A和全菌ELISA檢測菌毛抗原的表達情況。結果LB培養基既有利于疫苗株的生長(cháng)，又有利于細菌菌毛的表達。結論 LB培養基可以用于疫苗株中試和大規模培養。 

【關(guān)鍵詞 】 腸毒素大腸桿菌；疫苗株；培養基；斑點(diǎn)ELISA；菌毛

近些年來(lái)，腸毒素大腸桿菌( ETEC )疫苗候選株的研制主要是針對激發(fā)抗定居因子菌毛的腸道抗體和中和熱敏腸毒素的抗毒素，包括滅活的產(chǎn)菌毛的ETEC和純化的菌毛。由于死菌苗保護時(shí)間較短，以減毒的痢疾菌和沙門(mén)氏菌等為載體的ETEC疫苗應運而生。 

本文以志賀氏痢疾桿菌福氏2a疫苗株T32的asd(天冬氨酸-β-半醛脫氫酶)基因突變株為載體宿主，運用宿主/質(zhì)粒平衡致死系統，構建了表達ETEC菌毛抗原和腸毒素抗原的活菌口服疫苗候選株。動(dòng)物實(shí)驗結果表明，疫苗候選株具有良好的免疫應答反應。本研究的目的是尋找一種既適宜于疫苗株生長(cháng)，又有利于菌毛表達的廉價(jià)培養基，為疫苗的大規模生產(chǎn)奠定基礎。 

材料與方法

1．菌株

產(chǎn)生ETEC   CFA1／CS6菌毛的疫苗候選株FE16以及產(chǎn)生ETEC  CS3菌毛和腸毒素融合蛋白的疫苗候選株FE3；志賀氏痢疾桿菌福氏2a疫苗株T32的asd(天冬氨酸-β-半醛脫氫酶)基因突變株 FWL01。

2．培養基

CFA培養基(水解酪蛋白10g／L，酵母粉1．5 g／L ， MgSO₄·7H₂O  0.05 g／L，MnCl₂  0.005g／L。調pH至7.4 )；LB培養基(酵母提取物5g／L，胰蛋白胨10g／L，NaCl  10g／L，調pH至7.4 )；進(jìn)口TS培養基(Tryptone  15g/ L，Soytone 5g/L，NaCl 9g／L，pH 7.4 )和國產(chǎn)TS培養基(胰蛋白胨15g／L，大豆蛋白胨5g／L，NaCl  10g／L，pH 7.4 )。水解酪蛋白為DIFCO產(chǎn)品；酵母粉和酵母提取物為OXOID產(chǎn)品；胰蛋白胨和大豆蛋白胨為北京雙旋微生物培養基制品廠(chǎng)產(chǎn)品。 

3．抗體

抗CS3單克隆抗體由瑞典Gobebourgs大學(xué)Svennerhom教授惠贈；CFA多克隆抗體系本研究室制備；辣根過(guò)氧化酶標記的羊抗鼠及羊抗兔IgG購自Sigma公司。 

4．細菌培養

將疫苗候選株FE3或FE16  37℃過(guò)夜(16～18h)的培養物，按1％的接種量接種于含有100ml培養基的三角瓶?jì)�，�?/SPAN>37℃下震蕩(190～200r/min)培養，每2h取樣測定A₆₀₀，直至12h達到對數生長(cháng)期 為止。 

5．斑點(diǎn) ELISA 

每2h取的樣品，分別取5μl進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)�逐次點(diǎn)在0.45μm硝酸纖維素膜上。用含2％牛血清白蛋白和0.05％Tween20的PBS封閉，室溫30min。用PBST(PBS-0.05％Tween20)緩沖液洗1次，置于用封閉液稀釋的抗體中(抗CS3為單克隆抗體，1：3000稀釋?zhuān)��?/SPAN>CFAI 多克隆抗體1：1000稀釋)，室溫作用1 h。用PBST緩沖液洗5次。再置于用封閉液適當稀釋的羊抗鼠HRP-IgG(針對抗CS3單克隆抗體)或羊抗兔HRP-IgG(針對抗CFA/1多克隆抗體) 中，室溫作用30min。用PBST緩沖液洗5次。最后，加入酶底物溶液(0.05％Tris—HCl，pH7.4，  0.5mol／L  NaC1，0.06％二氨基聯(lián)苯胺，0.2％H₂O₂)顯色。待顯色適度后，用2mol/ L  H₂SO₄  終止反應，水漂洗后陰干并觀(guān)察結果。 

6 ． 全菌 ELISA 

將上述不同培養時(shí)間取樣的細菌培養物，于8000r/min  4℃離心5min， 然后用包被液( NaHCO₃  2.93g/L，Na₂CO₃ 1.95g/L，pH9.6)懸浮菌體并調整菌懸液的濁度均為A=1.0。用菌懸液包被酶聯(lián)板，100μ/孔，于4℃包被過(guò)夜。用PBST(PBS緩沖液加 0.05％Tween 20)洗滌3次。每孔加入200μ/L 3％封閉液( PBS緩沖液加3％牛血清白蛋白和0.05％Tween20)， 放置37℃保溫1h。用PBST洗3次，每孔加入100μl適當稀釋的抗CS3的單克隆抗體或抗 CFA/1多克隆抗體，置37℃保溫1h。用PBST洗滌3次，每孔加入100μl適當稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG，置37℃保溫1h。用PBST洗滌3次，每孔加入100μl底物顯色液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液[NaHPO₄  0.05mol／L，檸檬酸0.24mol／L， pH 5.0 ] 10ml 加鄰苯二胺 4mg和15μl  30％H₂O₂ ) 。待顯色適度時(shí)，每孔加入50μl  2mol／L  H₂SO₄終止反應，并用酶聯(lián)儀測定A₄₉₂值。 

結  果

1．疫苗候選株生長(cháng)曲線(xiàn)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌基因工程疫苗FE16和FE3是以痢疾疫苗株FWL01 (T-32的asd基因插入滅活突變株)為宿主載體，分別克隆表達了產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的CFA/1、CS6菌毛和CS3菌毛及兩種腸毒素融合抗原。為了研究重組菌株的生長(cháng)規律，用LB培養基在37℃條件下振蕩培養。盡管FE16和FE3表達了外源抗原蛋白，但其生長(cháng)曲線(xiàn)與載體宿主 FWL01仍無(wú)顯著(zhù)差異 。 

2 ． 不同培養基對疫苗候選株生長(cháng)的影響

比較了4種培養基對疫苗候選株FEl6和FE3的影響，FE3在不同培養基中的生長(cháng)情況。FE16了生長(cháng)稍微旺盛外，與FE3本相同(結果未列出)。經(jīng)3次實(shí)驗的結果表明，LB和CFA培養基較之TS培養基更適合疫苗候選株 FEl6和FE3的生長(cháng)。 

3．不同培養基對疫苗候選株產(chǎn)生菌毛的影響

經(jīng)斑點(diǎn)ELISA檢測FE3疫苗株在不同培養基的CS3菌毛產(chǎn)生水平，結果以LB培養基最高。將FE3培養物稀釋到A₆₀₀ =1.0，用ELASA檢測3次結果均表明LB培養基有利于菌毛產(chǎn)生。 ( FEl6產(chǎn)生FA1的水平與上述結果基本接近) 。 

表 1  FE3疫苗株在不同培養基產(chǎn)生 CS3菌毛水平

討  論

腸毒素大腸桿菌是造成發(fā)展中國家嬰幼兒和旅游者細菌性腹瀉最主要的致病菌之一。其菌體表面的菌毛抗原是首要保護性抗原。ETEC疫苗的研究已有近20年的歷史，至今仍沒(méi)有理想的疫苗用于人體。本研究構建的載體活菌疫苗，特點(diǎn)是免疫接種后靠重組菌在機體內繁殖產(chǎn)生保護性抗原，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫性反應，同時(shí)活菌還起佐劑作用，是一種比較理想的疫苗類(lèi)型。通過(guò)比較不同培養基對疫苗株產(chǎn)生菌毛的影響，發(fā)現實(shí)驗室常用的成分 簡(jiǎn)單、費用低廉的LB培養基無(wú)論是在細菌生長(cháng)密度還是在菌毛表達方面，都適合本課題研究開(kāi)發(fā)的新型致腹瀉性研EC載體疫苗的培養，為今后疫苗的中試及大規模生長(cháng)奠定了良好基礎。以往為了利于野生型研EC產(chǎn)生菌毛，一般采用CFA培養基。而本實(shí)驗結果表明，LB培養基像CFA培養基一樣，有利于以痢疾桿菌為載體宿主的腸毒素大腸桿菌菌毛的產(chǎn)生。 

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